2014-2015学年高中生物（人教版）精品课件系列：选修3专题2第2节第2课时动物细胞融合与单克隆抗体3.pptVIP

第九章 细胞融合 与 单克隆抗体 Cell Fusion and Monoclonal Antibodies 二、动物细胞融合常用方法 病毒诱导细胞融合 PEG诱导细胞融合 电诱导细胞融合法 抗体的结构与功能 单克隆抗体的制备和生产 单克隆抗体的改造和应用 抗体是由B细胞受抗原刺激后分泌的蛋白质。 抗体分子：四条肽链组成，两条重链（H链）两条轻链（L链）。 结合区：抗体分子上有两个抗原结合区 可变区（V区） 稳定区（C区） 人体内的五种抗体 二、单克隆抗体的制备 单克隆抗体技术(monclonal antibody technology) 通常称B淋巴细胞杂交瘤技术，它是1975年英国学者George Kohler与阿根廷学者Cesar Milstein成功将经过绵羊红细胞免疫的小鼠脾脏细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞融合在一起，并获得了能产生特异性抗羊红血球单抗的杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体，这种单一类型的、只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。为此他们荣获1984年度的诺贝尔医学及生理学奖。 单抗的制备过程 1.动物免疫与亲本细胞选择 2.细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备 3.杂交瘤细胞的筛选 4.抗体阳性杂交瘤细胞的筛选 5.抗体阳性杂交瘤细胞株的克隆化培养 6.单克隆抗体的制备和冻存 7.单克隆抗体的纯化 1.动物免疫与亲本细胞的选择 免疫方法：体内免疫法或体外免疫法。 体内免疫法： 颗粒性抗原可直接注射入小鼠体内，可溶性抗原则与等量的弗氏完全佐剂混合后注入体内进行初次免疫； 追加免疫1～2次后，在无菌条件下取出脾或淋巴结并制成细胞悬液，细胞存活率在95％以上的用于融合。 体外免疫法： 直接分离大/小鼠淋巴细胞，调整密度为107个/ml，加入适当浓度抗原，CO2箱中培养； 4～5天后，收集被刺激的淋巴细胞，进行细胞融合。 淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大/小鼠 2.细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备 将免疫脾细胞和骨髓瘤细胞以2：1～10：1的比例混匀于50ml锥形离心管内，1200rpm离心7～10分钟，尽量吸净上清液，手指轻击管壁使管底沉淀的细胞铺展成薄层； 室温条件下，边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入PEG融合液，随后静置90秒； 再于5分钟内，边振摇边逐滴加入培养液或盐水缓冲液以终止PEG的作用，再静置10分钟。 3.杂交瘤细胞的筛选 加HAT培养基，稀释至细胞不超过2×105/ml; 将细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔培养板内，每孔0.1ml，若为24孔板，每孔0.5ml； 每隔2～3天半量换液，7天后可选择出杂交瘤细胞 HAT选择系统 HAT是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。 DNA合成途径有两种： 杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或者是胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一；HPRT-细胞的嘌呤核苷酸与TK-细胞的嘧啶核苷酸只能由全合成途径产生。 含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。 嘌呤核苷酸合成通路的阻断 淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。 杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。 在HAT培养基中，HPRT-或TK- 亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。 4.抗体阳性杂交瘤细胞的筛选 通过选择性培养后生长的杂交瘤细胞，仅有部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。从融合后8～9天后即可取培养上清进行抗体检测，根据抗原的性质、抗体类型及所需灵敏度等具体情况来加以选择。 颗粒性抗原可采用免疫荧光、51Cr释放试验、溶血空斑测定、补体依赖的细胞毒等方法来直接测定针对这些抗原的抗体。 可溶性抗原可以采用放射免疫、免疫酶标测定、间接血凝等方法测定。 5.抗体阳性杂交瘤细胞株的克隆化培养 利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。 克隆化培养过程中，一般要加能释放某些生长因子、促进杂交瘤生长的饲养细胞，例如小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞或胸腺细胞等。 克隆化培养方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用流式等。 有限稀释法 通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的 1）取出阳性孔内的细胞进行计数； 2）用培养液将其稀释到如10个细胞/ml； 3）于96孔板内每孔加0.1ml，其机率将为每孔落入 一个细胞； 4）加入一定数量的饲养细胞，经过8~12天后，可以 观察到有集落生长的孔； 5）根据