AFP基因表达的检测----长沙小离教程方案.ppt

引物问题 引物浓度过高：与模板错配，非特异扩增；产生引物二聚体 引物长度：一般18－28 bp；GC含量约50－60％ 配对引物的Tm值要相当 引物3’端应尽量避免互补，以免产生引物二聚体 引物3’端3个或3个以上的GC，容易结合到基因组GC丰富区域，导致错误扩增 点样或染胶问题 反应体系中忘记加入某种成分(无扩增产物）或分装mixture时出了问题； 目的片段太大，使用的DNA Polymerase 无法扩增出目的片段； DNA溶液中或反应体系中含有Taq 酶抑制剂，抑制了Taq DNA聚合酶的活性。 退火温度太高； Taq 酶活力不够或其他试剂有问题； 引物设计不合理，与模板不配对等。 导致PCR产物很少或无扩增产物的原因 凝胶电泳检测PCR产物时，目的扩增带很弱或看不到目的扩增带，应从以下几个方面寻找原因： AFP基因表达检测 RT-PCR (Reverse transcription PCR) 甲胎蛋白DNA序列 mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。 实验原理 实验步骤 被污染的试剂，缓冲液 移液器 使用的器皿及tip等 操作者的手，头发等 RNA操作中应注意的问题： 防止RNase污染 外源RNase的主要来源： RNA的提取 当处理RNA时，移液器专用 保证RNA实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液等留出专用； 溶液和试剂分装成小份保存； RNA电泳装置专用（清洗、处理、DEPC处理过的水冲洗）； 防止外源RNase污染的主要措施 准备所有的溶液和缓冲液时，使用无RNA酶的玻璃器皿，DEPC处理过的水，用于RNA的化学药品使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话，用0.1％的DEPC在37oC处理溶液1小时后在15psi(1.05kg/cm2高压蒸气灭菌15min。 180－300oC烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活RNA酶的商品化产品处理塑料制品； 使用新的、无RNA酶的一次性tubes, tips等； 在分离RNA的过程中用RNA酶抑制剂以抑制RNA酶的活性。 防止外源RNase污染的主要措施： 材料要新鲜; 裂解过程要同RNase活性抑制同步 防止内源RNA酶降解RNA RNA酶抑制剂 RNA酶是一种强有力的酶，在RNA分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的完整性。用来使RNA酶不发挥作用的RNA酶抑制剂主要有： DEPC(Diethyl-pyrocarbonate) 或DMDC(Dimethyl-dicarbonate) 氧钒核糖核苷复合物 RNA酶的蛋白质抑制剂 DEPC: 是高度活性的烷基化试剂，通过组胺基团乙氧基甲酸化形式破坏RNase的活性 氧钒核糖核苷复合物: 能与多种RNA酶活性位点结合并几乎百分之百地抑制RNA酶的活性 RNA酶蛋白质抑制剂Ribonuclease Inhibitor 可与RNase形成非共价的复合物，从而使RNA酶失活。不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用。 RNA提取 RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调节和cDNA的合成都是必须的，RNA的纯度和完整性对于Northern blot, RT-PCR和cDNA文库的构建等分子生物学实验都至关重要。RNA分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少RNA酶的污染。 甲胎蛋白-----作为原发性肝炎HCC肝癌微小转移标志物 实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳带评价RNA质量 实验材料：水HCC 患者的外周血单核细胞（PMNCs）AFP mRNA 1. 外周血单个核细胞( P MNCs) 的分离 　 取受检者外周血 5 ml , 肝素抗凝 。采用密度梯度离心法 , 用淋巴细胞分离液分离收集 P MN Cs 。 2. . P M NCs 的总 R NA 的提取 用 Tr iz ol R N A 提取液( GI BCO BRL ) , 以改良的异硫 氰酸胍 - 酚 - 氛仿一步法提取总 R AN , 放 - 80 ℃ 保存 。 并抽提 Hep G2 细胞株的总 R N A , 放 - 80 ℃ 保存 提取方法： RNA降解的主要原因 取样后没有立即抽提RNA； 抽提过程中超作不当，样品量超过了许可的范围； 样品运输、保藏不当，或RNA保藏不当，应放入-70 ℃ ，而不是-20 ℃ ） 使用的溶液或器皿有RNase污染 琼脂糖变性胶（甲醛）电泳时pH值低于3.5 RNA污染的原因 样