实验溶菌酶的粗提取分离纯化及酶活力纯度及分子量测定剖析.pptVIP

* 记录仪 现代化层析设备——AKTA 层析柱XK BPG 实验2.1 层析柱的填装 1.观摩 2.实验步骤 1）测定酶浓度（S-2） C(mg/ml)=A280/13 2）若填料载量为20mg/ml，计算拟纯化100mg 蛋白需要的填料量和量取量。 * 3）装柱要点： a. 用纯水将乙醇保存液置换 b. 柱头及柱底适配器确保无气泡，可用注射器推注赶气泡，并确保连接管路密闭无泄漏。 c. 填料倾倒入柱管内前先加入少量水覆盖柱底 d. 柱拆卸后填料务必回收，并保存于20%乙醇中。 * 二、酶的活力单位及酶活测定： 1. 酶活单位：1961年国际生化协会酶学委员会统一规定，酶的国际单位（IU）规定为：在最适反应条件（温度25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量（或1分钟内转化底物生成1微摩尔产物的酶量）称为1标准单位。 * 2.酶的比活力： 每单位酶蛋白所含的活力单位数。 对固体酶：用活力单位/mg酶蛋白、或活力单位/mg酶蛋白氮来表示； 对液体酶：用活力单位/ml酶液来表示。 很明显，比活力越大，酶的活力越大。 分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质 或产物有紫外吸收的能力可采用此法。 测压法：产物中有气体，测气压增加量。 滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定。 荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂 反应生成荧光产物可用此法。 旋光法：产物中有旋光物质可采用此法。 除了以上方法外，还可根据产物的性质采用其它方法。 3.具体测定方法 4. 回收率和纯化倍数 回收率＝ ×100％ 提纯后酶总活力 提纯前酶总活力 纯化倍数＝ 每次比活力 第一次比活力 * 实验2.2溶菌酶的活性测定 实验材料： 1. 枯草芽孢杆菌悬液 2. S1，S2 3. PBS等 4. 分光光度计、比色皿、计时器、离心机等 * 实验步骤： 1. 取6ml 菌悬液，3500rpm*5min，弃上清，沉淀 6ml PBS重悬。 2. 测定OD600并记录（吸光度0.5~1.0，若读数过高可适当稀释） 3. 测定样品准备（酶液务必在仪器等条件准备好，临测定前加入） 比色皿 1 2 3 4 PBS缓冲液/ml 5 - - - 细胞PBS悬液/ml - 5 4.8 4.8 酶液S1/ml - - 0.2 酶液S2/ml 0.2 * 实验步骤： 4. 酶活性测定，以①管（PBS）为对照，每隔30s 测定2,3,4管的OD600并记录 5. 酶活力及比活性计算： U=(ODn-OD2)/0.001*T(min)*0.2 C(mg/ml)=A280/13 6. 纯化回收率及纯化倍数计算 时间（s） 0 30 60 90 120 150 180 2号 ? ? ? ? ? ? ? 3号 ? ? ? ? ? ? ? 4号 ? ? ? ? ? ? ? 回收率＝ ×100％ US2*V2 US1*V1 纯化倍数＝ S2比活力 S1比活力 * 样品 体积 ml 蛋白浓度mg/ml 总蛋白 mg 活力 u/ml 比活力 u/mg 总活力 U 回收率% 提纯倍数 S1 V1＝ ? ? ? ? ? 100 1 S2 V2＝ ? ? ? ? ? ? ? 7. 完成下表 * 实验3溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定 实验目的: 1、通过实验的学习与操作，在实验过程更好的理解SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）测定蛋白质纯度与分子量的原理与依据； 2、掌握电泳原理以及SDS垂直板电泳分析蛋白质技术； 3、熟悉垂直板电泳操作原理和方法，凝胶染色与脱色方法，SDS分子量测定图谱的绘制与计算； 4、了解在电泳中分子量标准物的使用。 * SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE）简称SDS－ PAGE。 用于蛋白纯度及蛋白质亚基相对分子量（relative molecular mass, Mr）测定。 1.原理 * 1.原理 SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。 SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。 因此