葡萄基因组DNA提取方法的比较.pptVIP

  1. 1、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。。
  2. 2、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载
  3. 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
  4. 4、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
  5. 5、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们
  6. 6、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
  7. 7、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
制作人: 指导教师: 提取高质量的基因组DNA是分子生物学研究的基础,植物组织DNA提取一般采用CTAB法和SDS法,它是对植物进行分子生物学分析的最基础一步工作。植物基因组DNA提取方法的改进将会广泛应用于遗传多样性研究领域,并推动植物遗传学的研究。 在本研究中,我计划摸索,寻求更好的途径,改进DNA提取方法,为以后的研究工作提供方便。因此改进植物基因组DNA提取方法是具有很重要的理论意义和现实意义。 1.DNA提取方法 1.1 CTAB法 (1)实验原理 CTAB 低离子强度溶液 高离子强度溶液 沉淀核酸与 酸性多聚糖 与蛋白质,多聚糖形成复合物 不能沉淀核酸 加入有机溶剂抽提, 去除蛋白质、多糖、酚类等杂质 加入乙醇,可沉淀核酸 (2)实验方法 CTAB提取液 预热 研磨 水浴30min 加入乙酸钾 水浴,离心, 取上清 (氯仿:异戊醇)抽提 离心,取上清 离心,弃上清 TE溶解 37℃保温60min 取上清, 加无水乙醇 沉淀DNA 离心 弃上清 乙醇洗涤 离心 弃上清 TE溶解 抽提,离心 (1)实验原理 1.2 改良SDS法 高浓度SDS抽提缓冲液 裂解植物cell 染色体离析 蛋白质变性 释放出核酸 高盐浓度(KAc)和降低温度 除去蛋白质和多糖 离心除去沉淀 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提 反复抽提 无水乙醇使DNA沉淀 在低温条件下 KAc与蛋白质及多糖 结合成不溶物 (2)实验方法 洗净 研磨 SDS提取液 水浴,加入KAc -20℃水浴 离心,取上清 加氯仿/异戊醇 离心,取上清 加异丙醇 离心 75%乙醇 洗涤 TE溶解沉淀 加氯仿/异戊醇 离心,取上清 加RNAase 37℃1h 加氯仿/异戊醇 离心,取上清 加醋酸铵 无水乙醇 静置,离心 弃上清,干燥 TE溶解 加RNAase 2.DNA质量检测 2.1 DNA电泳检测分析 1~3为改良SDS法,4~6为CTAB法,可以看出均有拖尾现象发生;点样量相等,CTAB法提取的DNA中RNA消化不完全,但从亮度看,所提取的DNA峰值较高。说明CTAB法较改良SDS法提取的葡萄DNA产率高。 图1葡萄基因组DNA电泳检测结果 处理 OD260 OD280 OD310 OD260 /OD280 产量 改良SDS 1 0.598 0.339 0.056 1.764 1355 2 0.624 0.355 0.048 1.758 1440 3 0.556 0.312 0.039 1.782 1292 CTAB 4 0.636 0.334 0.062 1.904 1435 5 0.685 0.348 0.067 1.968 1545 6 0.793 0.397 0.069 1.997 1810 2.2比色参数测定比较 改良SDS法的OD260 /OD280 1.7~1.8之间,CTAB法的OD260 /OD280在1.9~2.0之间,说明该方法提取的DNA样品中基本无多糖和酚类等杂质的污染,但是RNA未消化彻底,需要增加RNase。 表1 不同葡萄基因组DNA 提取结果比较 2.3 RAPD-PCR扩增 试验采用10μl反应体系,其中含 Tris-HCl, KCl,MgCl2,dNTPs,Taq 酶,模板DNA, 引物。 扩增程序: 94 ℃预变性4 min; 94℃变性30s, 30~ 40℃退火40s, 72 ℃延伸1 min, 40个循环; 72℃延伸10 min; 4℃保存。 图2 不同方法提取模板DNA对RAPD反应的影响 1~3为改良SDS法,4~6为CTAB法。前者扩增条带暗淡,说明RAPD-PCR扩增结果受模板DNA浓度影响较大。如样品中蛋白质、多糖及酚类物质较多,扩增条带就比较微弱,本试验充分说明了这一点。 3.讨论 CTAB是种去菏剂,它既可以裂解细胞,又可与DNA形成复合物而溶于高盐溶液中,当盐浓度降低时此复合物将析出,同时CTAB法有效地沉淀多糖。对酚类化合物的去除效果不是很理想,实验步骤也比较繁琐。 SDS也是去污剂,可直接裂解细胞,使其释放出DNA,提取DNA的质量很好。但是,其产量很低,且不能有效去除酚类和多糖类杂质,DNA降解严重并且操作繁琐。而CTAB法操作简单,产物的杂质较少,DNA降解程度轻且纯度高,充分满足分子检测的要求。 两种方法所提取的葡萄基因组DNA均可用于PCR操作.所得RAPD条带清晰,重复性好。其中改良SDS法的DNA浓度虽低,但扩增后产物浓度却很高,说明所得DNA的质量较高,相反CTAB的质量就较低。总之,扩增后的分析结果与上述结果基本保持一致。总之,CTAB法效果较好,当然实际应用中可根据具体的要求选择适当的提取方法。

文档评论(0)

三四五 + 关注
实名认证
文档贡献者

该用户很懒,什么也没介绍

1亿VIP精品文档

相关文档