核酸研究的基本技术剖析.pptVIP

Tm值(DNA的熔点或解链温度) 概念：指加热变性使 DNA的双螺旋结构失 去一半时的温度。 分类 按用途分类 克隆载体 表达载体：含有强启动子，使克隆化的外源基因转录产生大量 的mRNA。依其发挥作用的宿主细胞不同，分为 原核、真核、酵母、昆虫、病毒表达载体。 分离：碱裂解法、煮沸法：剧烈，小质粒 去污剂(SDS)裂解法：易受损的大质粒 (15kb) 碱裂解法 1、原理: 模板变性、引物退火、DNA pol进行DNA合成 1)长度一般为18~25个碱基； 2)尽可能选择碱基随机分布的序列； 3)两条引物的G+C的百分比应尽量相似，多为45~55%； 4)避免引物内部形成二级结构； 5)两引物之间不应发生互补，特别是在3′端; 6)引物3′末端碱基可以影响Taq酶的延伸效率，最好 选T、G或C，而非A； 7)引物5′端允许有一段序列不与模板配对, 内切酶，保护碱基。 退火温度计算公式： 1) T=2×(A+T)+4×(G+C)-3~5 2) T=22+1.46 ln±3~5 ln=2(G or C)+(A or T)