基因工程-教材.pptVIP

（3）提高克隆基因表达效率的实验方案 BamHI EcoRI EcoRI酶切 BamHI 具EcoRI末端的克隆片段 BamHI T4连接酶 EcoRI EcoRI BamHI酶切 S1核酸酶消化 通过控制消化时间制造不同缺失大小 Lac启动子片段 克隆基因 T4连接酶 EcoRI EcoRI Lac启动子片段 EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI 2、质粒载体的生物学特性与基因表达效率 （1）质粒的拷贝数 由于细胞中的核糖体数量与任何一种mRNA分子数量相比，都是大大超量的。因此，增加mRNA分子数量是提高克隆基因表达效率的有效途径。 增加mRNA分子数量的因素有两种：1）启动子强度；2）基因的拷贝数，即基因剂量；最简易的方法是将基因克隆到高拷贝的质粒载体上。 质粒的拷贝数受质粒复制控制区和宿主菌的遗传背景影响。迄今所使用的绝大多数高拷贝数的质粒载体，都是由ColE1衍生而来的。 ColE1及其衍生质粒的复制，受两种负调节成分的控制：RNAI和Rom蛋白质。 * * 第二章 真核基因在大肠杆菌中的表达 一、真核基因的大肠杆菌表达体系 目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性： （1）背景清楚，特别是对其基因表达调控的分子机制有了比较深入的了解。 （2）大肠杆菌已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列 。 （3）试验已经证明，许多克隆的真核基因。例如抑生长素基因和胰岛素基因等，都可以在大肠杆菌细胞中实现高表达。 （4）培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化生产。 二、大肠杆菌的表达载体 1、大肠杆菌表达载体的基本成分 TTGACA。。。。。TATAAT -35 17 -10 P R TAAGGAGG（N）8 ATG（91%） GTG（8%） TTG（1%） 编码序列 TAA TGA TAG TT tetr Ori RBS （1）启动子 要使克隆的外源基因高水平表达的最佳启动子，必须具备以下几个条件： 1）必须是一个强启动子。 2）这个启动子应能呈现一种低限的基础表达水平。使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件。 3）这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。 （2）转录终止子 * 当上游启动子驱动的转录作用通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制。—启动子封堵作用 * 在克隆基因编码区的3’-末端接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读。 此外，转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，从而大大提高蛋白质产物的水平。 （3）翻译起始序列 mRNA转录本5’端的独特的结构特征，是决定mRNA翻译效率的主要因素。 至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方法，从而提高克隆的外源基因的表达效率。 例如: 在RBS序列中增加AT含量；诱发特异碱基发生定点突变；以及使用翻译偶联系统进行克隆基因的表达。 （4）翻译增强子 大肠杆菌和噬菌体基因中存在一些特殊的序列元件，能够显著地增强异源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率。这类特殊序列元件特称为翻译增强子。 例如：T7噬菌体基因10的前导序列（g10-L）、以大肠杆菌atpE基因为代表的一些mRNA分子5’-UTR中的富含U的区段，以及直接位于T7基因起始密码子下游的“下游元件”等。 分子机制不明。 （5）翻译终止密码 对mRNA翻译终止而言，一个必不可少的条件是必须存在终止密码子。因此，在构建大肠杆菌表达载体时，通常安置上全部的三个终止密码子，以便阻止发生核糖体的“跳跃”现象。 已知大肠杆菌格外偏爱使用终止密码UAA，尤其是当连上一个U而形成UAAU四联核苷酸的情况下，翻译终止的效率进一步提高。 2、常用的大肠杆菌表达载体 迄今为止，基因工程学家已经设计并构建了一系列的以原核启动子取代真核启动子的质粒表达载体系统。 最常用的：?噬菌体的PL启动子，大肠杆菌的Lac启动子、Trp启动子，以及pBR322质粒的?-内酰胺酶启动子等一批强启动子构成的。 三、大肠杆菌的转化方法 1、Cohen转化法 1972年Cohen改进而成，是目前最常用的方法。 操作步骤： （1）将处于对数生长期的新鲜培养物（0.5-0.6OD)，于4℃, 4000转/分钟离心10分钟，回收细菌细胞； （2）将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2溶液重新悬浮细胞沉淀，以诱导细胞感受态产生； （3）加入适量的D