第二基因工程的载体和工具酶剖析.pptxVIP

第二章 基因工程的 载体和工具酶;第一节 载 体;⑴载体必须是复制子。;（一）质粒载体的生物学特性 （二）质粒载体的制备 （三）质粒载体的改造 （四）几个常用质粒载体;;;;;（7）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种 ;（二）质粒DNA的制备;碱变性法质粒提取的原理;碱裂解法提取质粒;加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心 12000g × 10min;溶液 I;溶液II;溶液III;25/24/1的苯酚/氯仿/异戊醇;2.5倍体积预冷的无水乙醇;TE缓冲液含RNase（50 ug/ml）;颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快 超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快 线性DNA分子比开环DNA分子快 线性DNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比;⑸改造或增加基因表达的调控序列。;（四）几个常用质粒载体;1. 质粒pBR322;pBR322 4363; 外源DNA;2. pUC质粒载体;2. pUC质粒载体;;;第二节 基因操作的工具酶;（一）限制性核酸内切酶的发现 （二）限制性核酸内切酶的分类 （三）限制性核酸内切酶的命名 （四） II型限制性核酸内切酶的基本特性 （五）限制性核酸内切酶的消化反应;;E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶;;最早分离出的限制内切酶—1968年，Meselson和Yuan，大肠杆菌B和K菌株，EcoB和EcoK， 是I型的，没有实用价值。;（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性;（三）限制性核酸内切酶的命名;（四）II型限制性核酸内切酶的基本特点;几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点;与II型核酸内切酶有关的几个概念;平齐末端; 经同尾酶消化的DNA末端连接示意图; 一个限制酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，1h内中完全降解1 ?g ? DNA所需要的酶量。 影响酶活性的因素很多，最重要的有： ⑴　DNA的纯度 ⑵　 DNA的甲基化程度 ⑶　酶切反应的温度（通常为37℃ ） ⑷　DNA的分子结构 ⑸　 核酸内切限制酶的缓冲液 在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性。用*表示。 ;酶 切 反 应 的 基 本 步 骤;（一）DNA连接酶的发现 （二） DNA连接酶作用特点 （三） DNA连接酶的反应条件 （四）DNA连接的策略;（一）DNA连接酶的发现;（二）DNA连接酶作用的特点; ;（三）T4DNA连接酶连接反应的条件;（四）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案;粘性末端DNA片段的连接～DNA连接酶连接法;平末端DNA片段的连接－末端同聚物加尾法;平末端DNA片段的连接－衔接物连接法;（一）大肠杆菌DNA聚合酶I （二）Klenow片段酶 （三）T4 DNA聚合酶 （四）逆转录酶（反转录酶）;CCG GGCTATCGGA; 大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途; 大肠杆菌聚合酶I的应用示例; （二） Klenow片段酶;Klenow片段的主要用途（利用5’ →3’ 的聚合酶活性） ⑴修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端 ⑵标记DNA片段的末端 底物用［α－32P］－dNTPs ⑶cDNA克隆中第二链cDNA的合成 ⑷DNA序列的测定; （三） T4DNA聚合酶; T4DNA聚合酶的用途; （四） 逆转录酶—Reverse transcriptase;（一）末端转移酶（terminal transferase） （二） SI核酸酶（SI nuclease） （三）碱性磷酸酶;末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。 特性：该类酶可以在没有模板链存在的情况下，将核苷酸连接到dsDNA或ssDNA的在3’－OH。特别是对于平末端的双链DNA末端加尾???分有用。 最常见的用途：给外源DNA片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴，以创造黏性末端，便于重组。;平末端DNA片段的末端加尾连接法; （二）SI核酸酶;其主要用途有： ⑴　在cDNA合成过程中，切开cDNA的发夹末端； ⑵　载体构建过程中，切去DNA片段的单链尾巴， 形成平末端结构。;; （三） 碱性磷酸酶;载体去磷防止自连的应用示例;基因工程的基本步骤