扩增基因全长实验技术剖析.pptVIP

RACE PCR 每50ul的体系中先合成41.5ul的Master Mix: 34.5ul PCR-Grade Water 5.0ul HiFi PCR Buffer 1.0ul dNTP 1.0ul HiFi Mix RACE PCR PCR反应体系： 5’RACE ready cDNA : 2.5ul UPM（10*）：5ul GSP1（10uM）：1ul Master Mix：41.5ul Total：50ul 扩增基因全长实验技术 获取基因全长简介 基因初步验证 基因全长获取（RACE技术） RACE产物鉴定 4 1 2 3 以介绍5’RACE技术为主 5 对序列进行生物信息学分析 目录 为什么要获取基因全长？ 什么是EST？ 获取基因全长基本流程？ 获取基因全长简介 EST (Expressed Sequence Tag)表达序列标签—是从一个随机选择的cDNA 克隆，进行5’端和3’端单一次测序挑选出来获得的短的cDNA 部分序列,代表一个完整基因的一小部分,在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等,平均长度为360 ±120bp 。 获取全长cDNA是研究 基因功能的关键，是 进行基因功能及产物 分析的必要前提。 获取基因全长基本流程 构建数据库 筛选EST序列 普通PCR进行初步验证 RACE技术 生物信息学分析 库 筛选EST 基因初步验证 获取基因全长 进行全序列分析 以本实验室具体情况为例子 生物信息学分析 Blast比对 ORF比对 相似序列多重比对 家族成员多重比对 PCR扩增 凝胶回收 测序 设计引物 提取RNA 反转录 PCR扩增 Ⅰ电泳检测 Ⅱ凝胶回收 Ⅲ电泳检测 Ⅳ克隆 PCR产物测序 凝胶回收测序 克隆后菌液测序 克隆后质粒测序 基因初步验证 RACE技术 方法 RACE 简介 试剂盒 选取 5’RACE 原理 实验 过程 基因全长获取 cDNA末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法。 分为3’RACE 和5’RACE RACE 简介 Clontech公司 全称： SMART RACE cDNA amplification kit 优点： 操作简便，成功率较高，全长分子的比例较高 价钱：中等偏上。 缺点： 不知道能否拿到完整的5’UTR. 试剂盒 选取 5’RACE 原理 5’ polyA 3’ Oligo(dT)primer 5’ polyA 3’ cDNA第一条链合成机制 polyA 3’ polyA 3’ 3’ 5’ 5’RACE 原理 polyA 3’ 5’ 3’ LUP Suppression PCR:阻抑聚合酶反应 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ GSP1 3’ GSP1 SUP 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 实验 过程 合成cDNA第一条链 （1）制备A管：加好后放在室温下。共计4ul。 2.0ul 5X First-Strand Buffer 1.0ul DTT(20 mM) 1.0ul dNTP Mix(10 mM) 4.0ul Total Volume （2）制备B管：冰上操作。 1.0-2.75ul RNA 1.0ul 5-CDS Primer A 再加入无菌水，使体积达到3.75ul。 混合溶液，并用掌上离心机离心。72℃ 3分钟，42℃ 2分钟。此过程可在PCR仪中进行。之后14000g离心10s。如果是做5’RACE，则加入1ul SMARTer IIA oligo。 此时B管体积为4.75ul。 实验 过程 合成cDNA第一条链 （3）在上一步放入PCR仪中后，在之前放在室温下的A管中加入：（室温进行） 0.25ul RNase Inhibitor(40 U/μl) 1.0ul SMARTScribe Reverse Transcriptase(100 U) 加上之前A管中的4ul，此时总体积为5.25ul。 （4）将A管中的混合液体5.25ul加入到B管4.75ul中。使体积达到10ul。缓慢吸打混合，离心至管底部。之后将管放在PCR仪中42℃90分钟。70℃10分钟。 （5）在管中加入Tricine-EDTA Buffer 100ul。（在总RNA的浓度≥200ng时） -