单克隆抗体的制备剖析.pptVIP

丁乔棋 2015年8月9号 单克隆抗体的制备 Monocolonal antibody 什么是单克隆抗体？ 1、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）： 由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体 称为单克隆抗体。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。 单克隆抗体制备原理 - - - - - 单克隆抗体杂交瘤技术基本流程 在培养基中加入氨基嘌呤，收集增殖细胞！ 3种杂交细胞：①B-B融合细胞、②杂交瘤细胞 ③瘤-瘤融合细胞 未融合的细胞：④单个的B细胞、⑤单个的骨髓瘤细胞 这五种细胞中， ① ④没有分裂能力，逐渐衰老死亡； ③ ⑤的DNA复制只有D途径， 加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，也逐渐衰老死亡， 但②的DNA复制有D、S两条途径，虽然D途径被氨基嘌呤阻断，但是还可以通过 S 途径进行DNA的复制，使细胞有分裂能力。 单克隆抗体的制备步骤 一：免疫原的制备 ： 1：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于5000Da生物物质 2：半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000 Da 物质 3：半抗原需与BSA、OVA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体  单克隆抗体的制备步骤  免疫动物的选取：6-8周龄的雌性，纯系的Bal B/C。 免疫原：细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次 可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周 100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫。 ?免疫程序： 免疫剂量、免疫途径、免疫次数、 间隔时间、佐剂的选择。 二.动物免疫 单克隆抗体的制备步骤 抗原接种  单克隆抗体的制备步骤 三：细胞融合细胞融合的基本原理是免疫原刺激小鼠产生特异性的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞,在PEG融合剂或是电刺激或是激光刺激来促使细胞融合形成杂交瘤细胞。蹄选得到的杂交瘤细胞继承了 B淋巴细胞产生特异性抗体以及骨髓瘤细胞无限传代的特性,并以此进行大规模的细胞培养,生产出大量的特异性良好的单克隆抗体,为快速诊断试剂的研制奠定了坚实的基础。  所需试剂：培养液：RPM1640培养液，DMEM培养液，HAT培养液，HT培养液 细胞融合剂：PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而 有助于细胞融合 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度 与毒性有所不同  单克隆抗体的制备步骤  三.细胞融合 步骤 ● ·1：饲养细胞为小鼠的腹腔巨噬细胞。 单克隆抗体的制备步骤 1： 将脾细胞和骨髓瘤细胞5:1混合，加DM液，混匀 2： 离心，弃上清，磨成糊状 3：将离心管置于37°温水，摇动；边滴加PEG1450 4：加入DM液 5：离心，弃上清 6：HAT 重悬后加入96孔板，放入CO2培养箱 7：五天后，15%血清的HAT补液 8：八天后，彻底换15%血清DM液 三.细胞融合 ELISA方法筛选阳性孔 单克隆抗体的制备步骤 四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选 阳性孔 单克隆抗体的制备步骤 用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。 抗原抗体杂交法检测——呈阳性反应 四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选 间接ELISA方法筛选阳性孔 单克隆抗体的制备步骤 六：亚克隆 是为了获得稳定的阳性菌株 对检测有阳性且敏感性好的细胞要尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的会使产单抗的细胞丢失 单克隆抗体的制备步骤 筛选阳性细胞孔 HAT重悬阳性孔内的细胞 取10ul做倍比稀释 目标孔：80-100个细