HP-PRRSV(HuN4)截短Nsp2蛋白原核表达及其单克隆抗体制备.doc

摘  要  摘 要 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是在 1987 年在 美国首次发现，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状为特征的传染病。 自 2006 年开始，高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome, HP-PRRS)在我国的暴发与流行给养猪业带来了巨大的经济损失。在高致 病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus, HP-PRRSV)基因组中，Nsp2 基因的第 1447~1449 位和 1597~1698 位的核苷酸发生了缺 失，与我国 2005 年以前分离的 PRRSV 相比 Nsp2 基因的同源性仅为 69.9%~86.2%。本研究 以 HP-PRRSV(HuN4)为研究对象，在克隆并鉴定该病毒 Nsp2 基因的基础上，进行 Nsp2 蛋白 的原核表达，并制备相应单克隆抗体，为进一步探究 HP-PRRSV Nsp2 蛋白结构及其功能奠 定了基础。研究内容主要包括： 1 PRRSV Nsp2 基因的克隆及原核表达 根据 GenBank 中以登录的 HP-PRRSV (HuN4)全基因组序列，设计合成了 1 对特异性引 物，对 PRRSV 非结构蛋白 Nsp2 包含缺失区部分基因片段基因进行了 RT-PCR 扩增，将回收 的目的片段克隆到大肠埃希氏菌表达载体 pET-30a(+)中，构建了重组质粒 pET-H-Nsp2。将 pET-H-Nsp2 转化至大肠埃希氏菌表达菌株 BL21(DE3)，用 IPTG 诱导表达，SDS结果 表明，重组菌可表达分子量约为 63.5ku 的蛋白。经镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)纯化，获得 了高纯度的重组蛋白，Western-blot 结果表明，该蛋白与 PRRSV 阳性血清具有良好免疫反应 性。 2 HP-PRRSV(HuN4 株) Nsp2 蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 本研究利用原核表达的 PRRSV( HuN4)非结构蛋白 Nsp2 作为免疫原，免疫 6 周龄雌性 BALB/c 小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术获得 3 株稳定分泌针对 PRRSV Nsp2 蛋白特异性单 克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为 1A5、4B3、3C2，经测定它们单抗亚型分别为 IgG2b、 IgG1 和 IgG1。轻链均为 κ 链。3 株杂交瘤细胞诱导小鼠产生的腹水效价分别是 1:10240、 1:10240 和 1:20480，Western blot 结果显示，这 3 株单抗均能与 Nsp2 蛋白发生反应，间接免 疫荧光试验表明所得单抗能与 PRRSV (HuN4)感染细胞中的 Nsp2 蛋白特异性结合。本研究为 进一步探究 PRRSV Nsp2 蛋白结构及其功能奠定了基础。 关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征；Nsp2 蛋白；原核表达；单克隆抗体 I Abstract Expression of Truncated Nsp2 of HP-PRRSV（HuN4）in E.coli and Preparation of Monoclonal Antibodies against Nsp2 Abstract Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) characterized by severe reproductive disorders in sows and respiratory diseases in young pigs, was first recognized in the US in 1987. Since 2006, highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome (HP-PRRSV) outbreaks and the prevalence in our country had brought enormous economic losses. In the highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV) genome, it was oc