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?Western Blot原理 ?Western Blot流程 ?Western Blot常见问题 ?Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 ? Western Blot 可以： 1.从蛋白质混合物中检出目标蛋白质； 2.定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况； 3.用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。 ?若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal（激光共聚焦）应是首选的方法。 ?若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术（IP或co-IP）。 ?蛋白样品的制备 ?SDS?转膜 ?封闭 ?一抗杂交 ?二抗杂交 ?底物显色 ? SDS电泳 ? 转膜及抗体检测 ?胶不平？ ?凝胶漏液？ √胶板洗刷干净 √加入AP和TEMED的量要合适 √加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 √温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 √两块玻璃板底部要对齐 ?条带比正常的窄？ ?“微笑”或“倒微笑”条带？ √ 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 √拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 √样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 √胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适 ?凝胶肿胀或卷曲？ ?条带歪斜或漂移？ ?单个或多个白点？ ?转膜缓冲液过热？ √可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min √电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 √确保膜和胶块之间没有气泡 √缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温 1.蛋白分子量 10KD 2.蛋白的等电点 9 3.SDS浓度不合适 4.凝胶太厚 原因 对 策 1.蛋白分子量10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜 2.更换高pH值Buffer 3.在阴极buffer中加入0.005 - 0.01% SDS 可提高转膜效率 4.延长转膜时间 1.膜没有均匀浸湿 2.膜或者缓冲液污染 3.封闭不充分 4.抗体与封闭剂出现交叉反应 5.抗体浓度过高 原因 对 策 1.转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 2.拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 3.检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 4.杂交前检测一抗、二抗的工作浓度 1.抗体保存不当 2.抗原不充足 3.膜的漂洗过度 原因 对 策 1.抗体长期保存应在－70℃，使用前做效价检测 2.增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照 3.减少漂洗的时间和次数 1.一抗不是唯一特异的 2.二抗出现非特异结合 原因 对 策 1.制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点 2.设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合 1.抗体质量好价格高的厂家：Abcam，CST（cell signaling technology），RD，Roche，BD 2.抗体质量中等价格适中的厂家：Santa Cruz，Abgent，Novus
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