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遗传学研究方法与技术讲义 （理论教学部分） 王晓雯 农学与生物科技学院遗传教研室 二O一四年二月 第一讲 植物染色体的常规制片技术 第一节 染色体制片技术概述 1.染色体制片技术的意义 对染色体的观察是细胞遗传学研究的主要内容之一。可以说，细胞遗传学之所以发展为一门独立的学科，就是通过对染色体行为观察，由些去解释一些遗传现象而发展进来的。观察染色体的目的有两个： 观察染色体的形态、结构和数目的变化； 观察同源染色体在减数分裂中的联会行为，了解染色体之间的同源性，判断物种间亲缘关系的远近。 2.染色体制片的技术流程 2.1概念 染色体的常规制片技术：是指显示染色体的一般形态和结构的技术。 2.2技术类型 压片技术和去壁干燥技术是染色体制片的主要类型。 压片法是以人工外加的机械压力而使染色体分散。 去壁低渗法则是以酶分解细胞壁，以低渗液使细胞膜吸胀和火焰干燥及水表面张力而使染色体自行展开。 图1.1染色体常规制片技术流程图 压片法的优点是操作快速简便，节省材料。 去壁低渗法，染色体易于展开而不易导致染色体变形，尤其对一些含较多成熟细胞的组织，如芽、愈伤组织等效果较好。 两种技术成功的基础和关健是应获得大量染色体缩短适宜的分裂细胞。 取材 一般来说，凡是能进行细胞分裂的植物组织或单个细胞，例如，植物的顶端分生组织(根尖和茎尖)，幼小的花，居间分生组织，愈伤组织，幼胚及胚乳，大、小孢子母细胞的减数分裂时期，以及小孢子发育成雄配子过程中的两次细胞分裂等，都可以作为观察染色体的适宜材料。 在植物的生长发育过程中，各器官的分生组织或细胞的分裂活动，既有其自身发育的阶段性，又受外界环境条件的影响。只有充分掌握这些组织的一般结构和生长发育的一般规律，了解每个具体植物的生长发育特性，创造适宜的环境条件，才便于取得合适的材料。而准确的取材，是制作优良的染色体标本的基础。 1．取材部位 1.1根尖 根尖可以分为根冠、分生区，伸长区和成熟区。 图1.2根尖结构模式图 分生区：此部分约1～2mm长，多为等直径的细胞，细胞质浓厚、细胞核较大并约占整个细胞体积的3/4。分生区细胞均可进行不断的分裂活动，但是，不同部位的细胞分裂的频率是有明显差别的。此外，细胞分裂也是不同步的。 在植物体细胞染色体的研究中，根尖分生组织为最主要的材料，因为取材方便，分生区易于识别，如以种子萌发取根，则不受季节的影响，这是其他材料所不及的。 根尖材料可以从多种途径而获得，要根据具体情况从优选择。 1.1.1以种子萌发取根 这是最常用的主要方法。为获得良好的种子根，除种子的饱满度和生活力等种子的品质外，种子的萌发条件的选择，以获得生长健壮的根尖材料也很重要。经验表明，生长健壮的根尖不仅细胞分裂频率较高，而且染色体形态也较平直，而根尖生长势差的材料，不仅分裂频率低，而且染色体形态也多是扭曲的，即所谓的。 1.1.1.1滤纸培养法 适用于某些蔬菜作物的小型种子和禾本科植物种子的萌发。 1.1.1.2纱布培养法 即将种子用潮湿的新纱布包裹，置于加盖的玻璃容器中萌发，每天用温水洗涤1～2次。此法很适合多数小型种子的萌发，效果比前者为优。 1.1.1.3锯末或砂土培养法 基质消毒后，非常适于容易腐烂的豆类种子萌发。 1.1.1.4水培法 即取包装用的硬质泡沫塑料薄片，在其上打出大小适宜的小孔，然后将种子的胚一端朝下植人小孔中，与水面接触，制成培养床，使其飘浮在任一可盛水的大容器的水面上。此法不需换水，取根甚为方便，适合于各种大形种子的萌发。也适用于某些小鳞茎(例如大蒜)的萌发取根。 1.1.1.5试管培养法 某些稀少或珍贵的种子，或种皮含抑制萌发物质的休眠种子，可经消毒，剥去种皮接种在MS琼脂培养基上培养。此法培养的根尖生长良好，细胞分裂频率也较高，是很有效的方法。 1.1.2鳞茎水培取根 此法适用于洋葱、蒜、中国水仙、风信子等。水培中经常更换新鲜的同温水，是获得良好材料的关键。 1.1.3扦插取根 此法适用于扦插繁殖为主的植物，如杨、柳、桑、葡萄、菊花。 1.1.4从植株上直接取根 此法适用于大部分禾本科植物，例如，麦类作物在分蘖期长出的大量不定根，比种子萌发的根更健壮，是很好的材料。 1.2茎尖 一个营养生长的茎尖的宏观结构，一般包括生长锥和叶原基两部分。 图1.3茎尖结构模式图 茎尖的取材，主要适用于一些难以获得种子或种子不易发芽的木本植物。例如，许多果树、竹类、木本花卉等。 茎尖细胞柔嫩和易于制片，在用于压片法时，是比根尖更为优良的材料。茎尖取材困难和操作繁复是其主要缺点，其有生长季节的严格限制，休眠芽是不适于取材作细胞学观察的。其次，是取材时一般需要在放大镜下剥去幼叶，切取生长锥和叶原基部分，常常难免带有一些成熟细胞或是木质分子、结晶等。所以，许多茎尖材料不适于用压片法，