分生第四次讨论课.pptVIP

基因工程技术 主讲 周红辛 彭小珺 “ 组员 杜林 安思澎 西热桑姆 桑杰卓嘎 已知目的基因的cDNA序列(GenBank登录号: AK135903.1)，拟采用基因工程技术在哺乳动物细胞中表达该序列中的133-1941位核苷酸序列，请设计实验方案。 题 目 提取目的基因 对于题目的要求，我们采用DNA重组技术，即基因工程技术进行操作。以上四个步骤即DNA重组技术的四个基本步骤。 构建表达载体 导入受体细胞 检测与表达 步 骤 提取目的基因 本题中目的基因为已知的cDNA序列,根据已知信息在GENE BANK 中进行检索。 获得目的基因 使用PCR技术扩增 在对目的基因扩增的时，首先要设计引物序列，然后按照PCR技术步骤操作。 进入/genbank 输入登入号：AK135903.1 获得目的基因 提取目的基因 ? ? ? ? ? ?小鼠体外受精卵的cDNA ?日本理化研究所全长序列文库 ?卵透明带糖蛋白2 ?完整的插入序列 ?该cDNA序列共有2234个bp的碱基 检索结果 提取目的基因 获得目的基因 获得目的基因 提取目的基因 提取出雌性小鼠的卵细胞中的所有RNA 得到结果后，操作如右图。 1.小鼠卵透明带糖蛋白2的mRNA提取 2.mRNA逆转录为cDNA mRNA有poly(A)尾，需利用与之配对 的oligo(dT)进行反转录。 提取目的基因 设计引物序列 引物设计原则： 1.碱基要随机分布 2.G+C含量在40%~60%之间 3.引物之间和引物自身不能有连续4个 碱基的互补 4.引物长度在10~30个碱基之间 5.避开二级结构区 6.3端不可修饰，避免使用T 7.5端可以修饰 在pubmed找到AK135903.1的cDNA序列后，使用DNAman进入页面即可筛选出建议的引物，经过前面的引物设计原则分析后得到一对包含133-1941位点的扩增引物。 构建表达载体 载体的选择 表达载体的构建 表达载体的扩增 构建表达载体 载体的选择 选择载体主要依据目的，同时要讨论载体中应有适合的酶切位点，如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 1.题目中得到的扩增cDNA序列10K，一般选择用质粒做为表达载体。 2.获得人工质粒载体分子(?PBR322) 比较内容 质粒? λ噬菌体 黏性质粒 M13噬菌体 克隆容量(K) 10 22 40~50 1 基因组DNA文库 — ＋ ＋ — cDNA文库 ＋ ＋ — — 亚克隆 ＋ — — ＋ 序列分析 ＋ ＋ — ＋ 大肠杆菌表达 ＋ ＋ — — 注:＋表示可用，—表示不可用 质粒载体pBR322是大肠杆菌质粒载体，其优点有： 1.相对分子质量较小，为4361bp 2.带有一个复制起始位点 3.具有两种抗生素抗性基因4. 具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝 构建表达载体 表达载体的构建 1.碱性磷酸酶处理载体(去掉线性DNA分子5端磷酸根，防止质粒自身环化，便于与基因片段连接) 2.人工合成的基因接头常常在表达载体有特殊的限制性核酸内切酶的位点，用相同的限制酶(BamH I 375)对表达载体进行切割后进行体外连接。 限制酶:BamH I 构建表达载体 表达载体的扩增 1.利用转化技术把重组DNA质粒导入大肠杆菌细胞。 a.转化 b.感染 c.转染 2.进行目的基因的筛选。 a.遗传学方法 b.免疫学方法 c.核酸杂交法 d.PCR技术 e.酶切鉴定 限制酶:BamH I 导入受体细胞 真核细胞转染 1.磷酸钙共沉淀法 原理：外源DNA以磷酸钙-DNA共沉淀物的形成出现时，可使DNA黏附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内。 特点：不适用于原代细胞，操作简便但重复性差。 导入受体细胞 真核细胞转染 2.电穿孔法 原理：高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA 通过膜上形成的小孔导入。 特点：适用性广但细胞致死率高，DNA 和细 胞用量大， 需根据不同细胞类型优 化电穿孔实验条件。 导入受体细胞 真核细胞转染 3.DEAE-葡聚糖法脂体介导法 原理：带正电基团与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞。 特点：相对简便、结果可重复，转染时需除血清。其中DEAE-葡聚糖法对细胞有较大毒性，而脂体介导法对细胞无伤。 导入受体细胞 真核细胞转染 4.显微注射法 原理：用毛细玻璃管将DNA直接注入靶细胞核（多为受精卵）。 特点：转染细胞数有限多用于工程改造或转基因动