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第十七章 病毒基因工程 第一节 病毒载体 第二节 病毒与基因工程 病毒的一般介绍 病毒(virus)是一种介于生命与非生命之间的生命形式，是最原始的生命体。 病毒结构简单，没有细胞结构，由蛋白质外壳和一种核酸(DNA或RNA)组成。病毒粒子的体积极其微小，直径在10~300nm之间，能通过细菌滤器，需借助电子显微镜才能观察到它的存在。 病毒是一种严格的细胞内寄生生物，必须依赖宿主细胞内才能完成自身的复制增殖；一旦离开宿主细胞就失去了增殖能力，但保留了对宿主细胞的感染能力。 病毒几乎可以感染所有的生物体 病毒在生物系统中是一个独立的界(kingdom), 可感染几乎所有的生物体，在脊椎动物、无脊椎动物、植物、真菌和细菌(一般称细菌病毒为噬菌体，bacteriophage 或phage)中都有病毒的寄生。 有些病毒的宿主范围宽，可感染多种生物，如禽流感病毒可感染鸡、鸭、鸟、猪，其中某些分离株如禽流感病毒H5N1甚至感染人类； 有些病毒的宿主范围窄，只感染一种特定的生物，如杆状病毒科病毒仅感染某一特定种的昆虫，但还没有发现病毒的宿主范围超越了原核生物和真核生物的界限。 病毒的分类 自1892年伊万诺夫斯基(Iwanovski)首次烟草花叶病毒(TMV)以来，已发现各种病毒4千多种。由于对病毒间的进化关系知之甚少，以至于还没有一个获得一致赞同的病毒分类系统。 国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)对病毒的分类原则作了规定，现一般根据病毒分类依据有病毒的核酸类型(DNA 或RNA，单链还是双链)；病毒粒子的大小、形状、衣壳的对称性、有无囊膜；有时也根据它们所引起的疾病、传播方式等特征进行分类。而根据宿主的不同，把病毒分为脊椎动物(包括人类)病毒、无脊椎动物病毒、植物病毒和微生物病毒4大类。 病毒与基因工程 病毒因其具有结构简单，可通过感染而大量复制，易于操作和大量获得等特点，所以从一开始就成为分子生物学与基因工程研究的好材料，并对其发展起到了积极的推动作用。 自70年代基因工程兴起后，病毒成为基因工程的改造对象，包括病毒全基因组序列的测定，基因功能的鉴定，抗病毒药物的开发等，为病毒性疾病的预防、诊断和治疗提供先进的手段。 病毒作为基因工程的优良载体，在基因转移与表达、作物改良、疾病的基因治疗中发挥了巨大作用。 真核基因表达载体 质粒载体：在真核细胞中进行瞬时表达 整合质粒载体：将外源基因整合到真核细胞染色体上持续表达 病毒载体：病毒携带外源基因在细胞表达 病毒载体的特点 病毒的衣壳蛋白能够识别细胞受体(acceptor)，不需要额外添加辅助试剂就可直接将外源基因高效导入寄主细胞； 使用病毒衣壳蛋白、包装重组质粒DNA形成的假病毒颗粒(pseudovirions)，相当于构成了一种高效的转化体系； 病毒具有能够被宿主细胞识别的有效启动子； 多数病毒在其感染周期中都能够持续地复制，使其基因组拷贝数达到相当高的水平； 有些病毒在它们的复制过程中能高效稳定地整合到寄主基因组； 病毒载体的安全问题 目前，各种病毒载体已经广泛用于蛋白表达、疫苗制备、基因转移与基因治疗。 但无论是何种病毒载体，在构建和使用过程中都需要非常重视防止病毒本身的致病性以保证病毒载体的安全性。 第一节 病毒载体 1.1 动物病毒载体 1.2 植物病毒载体 1.3 噬菌体载体 1.1 动物病毒载体 1.1.1 SV40载体 SV40(Simian vacuolating virus 40, 猿猴空泡病毒)是迄今为止研究最为详尽的乳多空病毒之一，也是第一个完成基因组DNA全序列分析的动物病毒。 SV40病毒的基因组是环状双链DNA，大小仅为5243bp，与质粒大小相似，适于基因操作(图17-2)。 由于SV40病毒包装十分严格，不能包装大于SV40基因组的DNA分子，因此外源基因只能通过取代病毒本身的DNA片段进行克隆。其克隆外源片段的能力有限，只能达到约2.5kb。 两种类型的SV40病毒载体：置换型和穿梭型 置换型的重组病毒载体：一种是早期置换型病毒载体，另一种是晚期置换型载体。 在早期置换型病毒载体中，早期基因T抗原基因被缺失掉，因此重组后的病毒不能在正常的敏感细胞中进行复制，只能在一种可以持续表达T抗原的猴肾细胞即COS细胞中才能复制和繁殖。 在晚期取代型载体中，晚期转录区被外源基因取代。由于缺少晚期基因，病毒DNA不能被包装，因此必须由辅助病毒提供包装必须的蛋白质，而辅助病毒本身由于不能表达T抗原而不能复制。 两种类型的SV40病毒载体：置换型和穿梭型 重组的病毒-质粒载体：这是这一类穿梭载体，该载体中病毒基因组部分只保留下维持在哺乳动物细胞中进行复制所