第六讲_基因芯片数据质量.pptVIP

第六讲 Affymetrix芯片数据 Illumina芯片数据 双通道芯片数据(ScanAlyze) 双通道芯片数据(GenePix) 基因芯片数据质量 芯片图像的质量 芯片图像：没有杂质，例如太高或者太低强度的信号点，刮擦的痕迹，背景太高等等 好的双通道cDNA芯片 芯片误差来源分析 基因芯片技术是一种半定量的分析手段，存在误差而且很难克服。 芯片实验的误差来源可以归纳为两大方面：生物学差异和实验系统误差。生物学上的差异是内在的，受到遗传和环境因素的影响。实验系统误差包括两大类：一类是芯片制作带来的误差，另一类是样本检测过程的误差。 在芯片实验中要尽量降低生物学和实验的误差，对于后期的数据分析是至关重要的。 实验系统误差 基因芯片制备过程 ——克隆的准确性 —— PCR扩增及纯化过程 ——点样及点样后处理 样本的检测过程 —— RNA抽提方法 —— RNA的标记过程 —— 杂交过程 检测系统的误差 —— 硬件 —— 软件 —— 弱信号 克隆的准确性 目前cDNA克隆的来源主要是商业化公司提供的克隆，商品化的克隆准确性仅为65-85%, 其主要原因是由于含质粒的细菌培养及质粒抽提过程中的污染造成，另外，克隆重排过程人为的错误也是主要的错误来源。 PCR扩增及纯化过程 以下几个原因影响了cDNA的质量：A.模板的质量 ，要得到仅可能好的质量和产量，最好是纯化的自理做模板，模板不能有污染。B.PCR引物序列的特异性，不同引物的PCR扩增的效率和特异性不同，不好的引物常常会产生非特异性扩增，导致多带、smear，甚至没有任何扩增产物出现。 纯化方法的不同，也会影响芯片的质量。沉淀法由于离心力的不足，会导致回收率不稳定。树脂纯化法成本比较高，而且纯化得率也不如沉淀法。 点样及点样后处理 点样仪的精密度和磨损程度影响芯片矩阵的齐整度和点大小的均匀性，虽然理论上点的质量不影响两种荧光的比值，但由于软件对不同质量的点信号的提取和识别程度不同，所以会导致较大的误差 点样针的清洗性能是否好，在两次取样之间需要进行点样针的清洗，尤其对于裂缝针或空心针，容易有残留液体，导致DNA探针的交叉污染 点样针磨损程度，和针堵塞的情况造成点的大小和形状都不同 点样后处理包括，水合、交联、洗脱未结合的探针、封闭等步骤，这个过程会影响到DNA固定在芯片上的效率 RNA抽提方法 RNA的质和量直接影响标记效率和实验的成功率，可以说是导致芯片实验失败的最主要的原因 不同的物种、不同的组织类型由于细胞成分的不同导致RNA的纯度和得率有较大的差异，有些甚至需要特殊的实验流程 RNA的标记过程 标记反应的过程中不同的mRNA其逆转录效率会有所差异，从而导致误差。 标记过程中产生误差的主要因素有：（1）mRNA的固有性质与逆转录酶（2）逆转录引物 （3）荧光染料 （4）标记后产物纯化 杂交过程 杂交是个非常复杂的过程，它受到了各种各样因素的影响，如杂交的时间、空间、玻片的表面化学性质（亲水性、疏水性），cDNA在玻片表面上的分布和结构）、温度、杂交液的配方和浓度等等，如果考虑到探针和靶序列的长度、G+C含量、SNP(位点多态性)对于杂交及非特异性杂交的影响，情况会更复杂。 硬件 不同的扫描方式就会带来误差，即使使用同一类但由不同公司生产的扫描仪，由于硬件配置和光路设计的不同，也会带来一定的误差。 光漂白现象也会对芯片数据的质量带来一定的误差。 软件 芯片数据的一个很主要的误差来源。 不同软件的数据提取方法，由于其核心算法不同，同样的原始图片，最后得到的原始数据多少会有些不同。 同一套软件而言，取点（信号）和背景的原理也有好几种，得出的数据也有一定的偏差。 软件的质量会影响扫描图像定位的准确程度和数据的精确性等重要参数，因此需要选择质量好的图像处理软件。 如何减少误差 实验设计 — 重复。生物学重复，技术上重复 — 直接比较。使用正反标记或环式标记的方法来平衡染料和样本的差异。 实验过程的质控 — 制备过程的原材料检测 — 生产过程 — 成品质控 数据处理与矫正 原材料检测 基片 目前国内外还没有统一的基片质检方案，而且由于基片表面的化学基团的稳定性较差导致保存时间对其固定的效率影响很大，因此基片质量差异很大。 好的基片主要体现在背景低﹑DNA的固定能力强﹑平整度高等方面，因此质检也主要考察这三方面的参数。 质检时可以把它放在光亮处，仔细检查基片上是否有划痕，污点。每批抽出一定比例的基片，直接用标记有荧光染料的DNA探针点样、固定、洗脱，通过比较洗脱前后的荧光信号变化测定基片的固定率。 原材料检测 探针 对于cDNA芯片，所获得的cDNA克隆必须是经过严格测序的，而且克隆