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第七章 植物原生质体培养与体细胞杂交Plant Protoplast Culture and Somatic Hybridization 第一节 原生质体的用途 植物原生质体(protoplast)是没有细胞壁的裸露细胞，它在一些研究方面具有独特的优势。 1.原生质体是研究细胞骨架、细胞壁的形成、细胞膜的结构、大分子物质进出细胞过程与机理等问题的良好实验体系。 2. 转基因的良好受体：与外源DNA（如质粒）共培养时，原生质体可以直接吸收外源DNA，并整合到染色体上，从而实现对植物细胞的遗传转化，进一步通过植株再生就可得到转基因植物。 PEG介导的甜橙原生质体转GFP 3. 体细胞杂交（somatic hybridization）：由于原生质体没有细胞壁，所以不同的原生质体可以相互靠近，发生融合。2种不同植物体细胞发生融合的过程，称为体细胞杂交。所得到的融合细胞为杂种细胞，再通过植株再生就可能创造出新的植物个体。 第二节 原生质体的分离 要进行原生质体培养和操作，就必需有大量高质量的原生质体。分离原生质体主要采用酶解法。 酶解法：利用酶降解植物细胞壁而获得原生质体。酶解法分离原生质体的效率高，用少量的材料就可以得到大量完整的原生质体，已成为分离原生质体的最主要方法。 一、??? 材料的选择 用于分离原生质体的植物材料应是细胞分裂旺盛的材料，如幼嫩小苗的根、胚轴、子叶、幼叶等；处于快速生长期的愈伤组织或悬浮细胞。对于容易培养、再生能力强的叶植物（如烟草、菊花、胡萝卜、矮牵牛等）也可用完全展开的叶片作材料。 二、 酶解处理 1. 酶解液准备：由于植物细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素和果胶质组成的，所以酶解液中一般应含有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶，浓度为0.5-2.0%。在配酶解液时可以用原生质体培养基作溶解剂，也可用专门的溶液（CPW溶液）作溶解剂。 CPW=Cell-Protoplast Wash Medium KH2PO4 27.2 mg/L KNO3 101.0 mg/L CaCl2·2H2O 148.0 mg/L MgSO4·7H2O 246.0 mg/L KI 0.16 mg/L Cu SO4·5H2O 0.025 mg/L 为了保持释放出来的原生质体的活力和膜稳定性，必须使原生质体处于一个等渗环境中。因此，酶解液中 必须加入渗透压调节剂。 常用的渗透压调节剂有葡萄糖、甘露醇和山梨醇等，浓度一般为0.35-0.8mol/L。具体用什么浓度，可根据材料的水势来确定。 2. 酶解：将植物材料放入酶解液中、释放出原生质体的过程。 叶片、幼茎和根等材料要切成小片； 叶片最好撕去下表皮。悬浮细胞要离心后再酶解。 材料与酶解液的比例：2-10g/100ml酶解液。 一般在25±2℃、黑暗中酶解，期间轻轻摇动几次，或放在50rpm的摇床上。酶解时间因材料而异，2小时~十几小时。 三、原生质体的收集与纯化 过滤：酶解结束后，将酶解物通过孔径为20-80μm的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组织块和细胞团。 离心：滤液转到离心管中在50×g下离心5min。 反复洗涤：离心结束后，弃去上清液，用培养基和原生质体洗液重新悬浮沉淀的原生质体，再离心。如此反复2-4次，就可以将残留的酶液去掉。 纯化：用含高浓度（21%）蔗糖的培养基进行离心、纯化，完整的原生质体漂浮在上清液的上部。 四、原生质体活力的测定 原生质体活力的高低对后来的原生质体培养和融合影响极大。原生质体分离过程中的任何一个步骤都会影响到原生质体的活力，因此，必须十分小心。测定原生质体活力的方法常用荧光素双醋酸酯（FDA）染色法。 原生质体活力（%）=发荧光的原生质体数/原生质体总数×100 第三节 原生质体培养 在适宜的培养条件下，原生质体数小时后开始形成新的细胞壁，在显微镜下可见原生质体由圆球形逐渐变为方形、多边形等。约24-36h后，原生质体开始发生第一次分裂；以后随着细胞分裂，原生质体就形成细胞团， 进一步诱导出植株。 转GFP基因的苜蓿原生质体再生植株 夜来香原生质体植株再生 杨树原生质体培养植株再生 杨树原生质体培养植株再生 杨树原生质体培养植株再生 原生质体的培养方法 特点： 操作简单，对原生质体的损伤小； 容易添加新鲜培养基和转移培养物； 原生质体分布不均匀，易发生原生质体之间粘连； 原生质体的位置不能固定，所以不