普通微生物第十章微生物与基因工程.pptVIP

M13噬菌体载体 克隆能力较小 300~400bp 特别适合用于制备单链DNA模板、单链DNA探针、定位诱变模板 五、噬菌粒载体(phagemid/phasmid) 又称噬粒，由噬菌体M13的基因间隔区和质粒载体共同构建的载体 pUC118 将野生型M13的基因间隔区插入质粒载体 pUC18构建而成 在宿主细胞内以质粒形式存在，产生双链DNA；当辅助噬菌体M13感染宿主细胞后，以滚环方式复制，产生单链DNA 特点： 分子小 容量大 10kbp 可制备单链或双链DNA，克隆和表达外源基因 几类大肠杆菌克隆载体比较 载体类型 克隆容量 主要用途 质粒载体 15kbp 克隆和表达外源基因， DNA测序 λ噬菌体载体 23kbp 构建基因文库和cDNA文库 柯斯质粒载体 45kbp 构建基因文库 M13载体 300~400bp 制备单链DNA，定位诱变，噬菌体展示 噬菌质粒载体 10kbp 制备单链或双链DNA，克隆和表达外源 基因 六、真核生物的克隆载体 1.酵母质粒载体 利用酵母的2μm质粒和其他染色体组分与pBR322构建而成，为穿梭质粒 附加体质粒（episomal plasmid) 复制质粒(replicating plasmid) 整合质粒(integrating plasmid) 附加体质粒（episomal plasmid) 具有较高拷贝数 酵母染色体的自主复制序列 复制质粒(replicating plasmid) 中等拷贝数 整合质粒(integrating plasmid) 2.真核生物病毒载体 哺乳动物病毒载体—SV40、腺病毒、牛痘病毒、 逆转录病毒 昆虫病毒载体— 杆状病毒：高容量（100kbp)、 高表达效率(25%)、安全 植物病毒载体— 花椰菜花叶病毒载体，Ti质粒载体 七、人工染色体 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC) Murray 1983年构建，Burke等1987年用以构建成YAC克隆库，1000kbp容量 细菌人工染色体(BAC)-120-300kb §4微生物与基因工程工具酶 基因工程所用到的工具酶大多数是从不同微生物中获得的 一、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 限制性酶(restriction enzyme)： 能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近特异切割DNA的一类内切酶 1.命名与分类 Eco RⅠ Hpa Ⅰ, Hpa Ⅱ(Haemophilus parainfluenzae，副流感嗜血杆菌) Hph Ⅰ(Haemophilus parahaemolyticus，副溶血嗜血杆菌) Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ三种类型 2.限制性核酸内切酶的基本特性 识别序列通常由4~8bp组成，具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构(paliindromic structure) 切割片段理论大小为4n A.黏性末端(cohesive end) Hind Ⅲ 5’-A AGCT T-3’ 3’-T TCGA A-5’ Pst Ⅰ 5’-C TGCA G-3’ 3’-G ACGT C-5’ B.平末端 Hpa Ⅰ 5’-GTT AAC-3’ 3’-CAA TTG-5’ 同裂酶(isoschizomers) 同尾酶(isocaudomers) Mun Ⅰ Eco RⅠ 5’-C AATT G-3’ 5’-G AATT C-3’ 3’-G TTAA C-5’ 3’-C TTAA G-5’ 表10-2 常用限制酶 二、DNA连接酶(DNA ligase) T4 DNA连接酶：Mg2+和ATP 能催化平端连接 大肠杆菌DNA连接酶：Mg2+和NAD+ 其它酶 §5 外源基因导入宿主细胞 一、外源基因与载体的体外连接 1.黏性末端连接法 2.接头或衔接物连接法 3.均聚物加尾法 4.平末端连接法 二、宿主的基本要求与性质 1.具有安全性 2.能高效吸收外源DNA 3.不具有限制修饰系统 4.一般为重组缺陷型(RecA-)菌株 5.根据载体类型选择相应宿主 6.根据载体的标记选择合适的宿主 大肠杆菌、酿酒酵母 1、原核生物宿主