课用双向电泳技术.ppt

一、蛋白质双向电泳相关基本知识 二、双向电泳 1、2-DE常见问题及解决方法 2、对角线电泳SDS/SDS、Native/SDS三、2D-LC 一、蛋白质电泳相尖基本知识 1、电泳 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳 3、等电聚焦电泳 4、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 5、蛋白质的检测——显色剂 1809年俄国物理学家Peйce首次发现电泳现象。*1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。 70年代以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染胶三大环节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。 各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。 第一节 蛋白质电泳的基本原理 一、电泳的基本原理 1、电泳是在电场作用下产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的，称为电泳（electrophoresis)。 二、影响电泳速度的因素 1、电场强度；2、缓冲溶液的pH；3、缓冲溶液的离子强度；4、电渗；5、焦耳热 三、电泳的分类 按原理分类： 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。 区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。 ③淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。 ④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 ⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。 ?? 另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：薄层电泳、板电泳、柱电泳。?? 根据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定量电泳、免疫电泳。 按pH的连续性不同，可分为：连续pH电泳，不连续pH电泳。 四、聚丙烯酰胺凝胶电泳 第二节 蛋白质等电聚焦电泳 1966年，瑞典科学家Rible和Vesterberg建立。 等电聚焦：isoelectric focusing,IEF。 1.电泳系统中加进两性电解质载体，当通直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。蛋白进入时，不同的蛋白移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的蛋白得以分离。 2.优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定蛋白或多肽的等电点。 3.缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白。 利用蛋白质分子或其他两性分子等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的（或非线性）pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。分析对象只限于蛋白质和其他两性分子。 根据建立pH梯度原理不同，可分为载体两性电解质pH梯度（carrier ampholyte pH gradient)和固相pH梯度(immobilized pH gradient, IPG)。 一、基本原理 1、蛋白质的等电点：取决于其氨基酸的组成。 组成每一种蛋白质或多肽的氨基酸的数目和比例是不同的，故蛋白质的等电点范围很宽，这使得可以利用它来分离和分析蛋白质。 二、载体两性电解质pH梯度等电聚焦电泳 1、载体两性电解质应具备的条件 在等电点处有足够的缓冲能力，以便能控制pH梯度，而不致被样品的缓冲能力而改变pH梯度。 在等电点处有足够高的电导，以便使一定的电流通过，具备不同pH的载体有相同的电导系数，是整个体系中的电导均匀。 分子质量小，便于与被分离的高分子物质分离。 化学组成不同于被分离物质，不干扰测定。 应不与分离物质反应或使之变性。 由多乙烯多胺与丙烯酸加成制备(有不同pH范围的商品两性电解质载体) 3、载体两性电解质分离原理 等电聚焦样品可放于任何位置。 4、载体两性电解质的缺点 载体两性电解质合成过程复杂，影响蛋白质点的位置，从而影响了重复性； 负极漂移现象，使pH梯度不稳定； 负极漂移现象使碱性蛋白质无法聚焦； 凝胶灌制重复性差，凝胶机械稳定性差，影响重复性