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Contents 血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定 一、实验目的与要求 了解分离纯化蛋白质的基本原理； 掌握柱层析技术。 血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定 二、实验原理 血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定 二、实验原理 血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定 二、实验原理 血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定 二、实验原理 血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定 二、实验原理 血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定 二、实验原理 血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定 三、操作步骤 血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定 三、操作步骤 血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定 三、操作步骤 血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定 三、操作步骤 血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定 三、操作步骤 血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定 三、操作步骤 血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定 三、操作步骤 血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定 注意： 血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定 四、结果分析 Company Logo * LOGO 血清?-球蛋白的分离、 纯化及鉴定 实验十一 扬州大学医学院生化教研室 傅 奕 实验目的与要求 实验原理 操作步骤 结果分析 1 2 3 4 本实验为一综合性大实验，目的是要从血清中获得 纯化的?-球蛋白。 血清中的蛋白质有两大类：清蛋白和球蛋白（?、?、?）。 （一）如何分离得到球蛋白？ 盐析： 清蛋白在水中的溶解度大于球蛋白，在血清中加入硫酸铵 至半饱和时，球蛋白可被完全沉淀，而绝大部分清蛋白保持 溶解状态，依此可将球蛋白和清蛋白分离 (离心）。 得到球蛋白 （二）如何去除球蛋白中的无机盐（硫酸铵）？ 凝胶层析（凝胶过滤） 脱盐 凝胶层析又称凝胶过滤， 是选用孔隙大小一定的凝胶， 将混合液中的小分子和 大分子物质“筛”开来的 一种分离方法。 葡聚糖 G-25 纯化的球蛋白 （三）如何分离得到纯化的?-球蛋白？ 在乙酸铵溶液（pH6.5）中 ?、?-球蛋白带负电荷 而?-球蛋白带正电荷 （三）如何分离得到纯化的?-球蛋白？ 如何将带有不同性质电荷的蛋白质分离呢？ 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 离子交换是指溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆 的交换过程；带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带 负电荷的交换剂称阳离子交换剂。 本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，其分子带电 形式为：纤维素-OC2H4N+H(C2H5)2，溶液中带负电荷的离子可 与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达 到分离纯化的目的。 血清?-球蛋白的分离、纯化及鉴定 + （三）如何分离得到纯化的?-球蛋白？ 因?、?球蛋白带负电荷而与DEAE纤维素进行交换结合。 而?-球蛋白带正电荷而不与DEAE纤维素进行交换结合， 直接从层析柱流出。 故经DEAE纤维素阴离子交换层析流出的第一部分 蛋白质即为纯化的?-球蛋白。 纯化前后的?-球蛋白可用电泳法进行比较鉴定。 （四）如何鉴定?-球蛋白及纯度？ 1.盐析：分离球蛋白与清蛋白。 2.凝胶层析：去除球蛋白中的无机盐（脱盐）。 3.离子交换层析：将?-球蛋白与?、?-球蛋白分离。 4.电泳：鉴定?-球蛋白及纯度。 1.盐析：分离球蛋白与清蛋白 取血清0.75 ml，缓慢滴入饱和(NH4)2SO4溶液 0.75 ml， 边加边摇，混匀后于室温中放置10分钟，然后10000rpm 离心10分钟，并小心倾去上清液。沉淀加蒸馏水0.4 ml， 使之溶解，即为粗提的球蛋白溶液。 2.凝胶层析：去除球蛋白中的无机盐 （脱盐） （1）装柱： （a）固定层析柱，保持垂直。 （b）排气，并检查是否通畅。柱内留下约5ml乙酸铵。 （c）灌胶：用滴管沿管壁自顶部加入搅拌均匀的SephadexG-25悬液，打 开底部出口，凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降，不断加入 SephadexG-25，至凝胶层积集至约15cm高度即可，床面上保持有少 许溶液。关闭出口。 避免气泡、纹路，凝胶面始终低于液面。 如凝胶表面不平时，可用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉 降，使表层平整。 （2）上样与洗脱：凝胶面始终低于液面 使柱上缓冲液面刚好下降到凝胶床表面 用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢地加到凝胶床表面上 然后打开下端出口，使样品进入凝胶床，关闭出口 小心加入少量乙酸铵（约1ml）洗层析柱内壁上的样品， 打开出口，使溶液进入凝胶 加入适量乙酸铵溶液开始洗脱并收集洗脱液，每分钟收集15滴 淡黄色 仔细清洗试管 （3）