盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质讲述.ppt

盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离血清蛋白质 一、实验目的 1．学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。 2．掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。 3．比较醋酸纤维素薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离血清蛋白质的效果。 二、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体 monomer 丙烯酰胺 acrylamide，简称Acr 和交联剂 crosslinker 又称为共聚体的N，N一甲叉双丙烯酰胺 methyleme—bisacrylamide，简称Bis 在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。由于这种凝胶具有分子筛的性质，所以对样品的分离作用不仅决定于样品的各组分所带的电荷的多少，而且也与分子的大小有关。其次，此凝胶电泳还有一种独特的浓缩效应，因而较醋酸纤维薄膜电泳，琼脂糖电泳等具有更高的分辨率。 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好，化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，几乎无电渗作用，样品不易扩散，用量少 1～100μg 等优点。聚丙烯酰胺凝胶电泳应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可以测定分子量、等电点等。 一 聚合反应 聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化剂过硫酸铵 ammonium persulfate， NH4 2S2O8简称AP 或核黄素 ribofavin，即vitaminB2，C17H20O6N4 和加速剂N，N，N’，N’一四甲基乙二胺 N，N，N，N’一tetramethyl ethytenediamine，简称TEMED 的作用下，聚合而成的三维网状结构。催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有2种催化体系。 1.AP—TEMED 化学聚合作用 TEMED 是一种脂肪族叔胺，其碱基可催化AP水溶液产生出游离氧原子，然后激活Acr单体形成单体长链，在Bis作用下聚合成凝胶。 2．核黄素一TEMED 光聚合作用 TEMED可加速凝胶的聚合，但不加也可聚合。光聚合作用通常需要痕量氧原子存在才能发生，因为核黄素在TEMED及光照条件下，还原成无色核黄素，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合作用。但过量氧会阻止链长的增加，因此应避免过量氧的存在。 用核黄素进行光聚合的优点是：核黄素用量少 1 mg／100 m1 ，不会引起酶的钝化或蛋白质生物活性的丧失；通过光照可以预定聚合时间，但光聚合的凝胶孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备浓缩胶 大孔胶 较合适。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacryamide gel electrophoresis简称PAGE 根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类。前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；后者在电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH值、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。目前常用的多为垂直的圆盘及板状两种。 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成，它们在直立的玻璃管中 或2层玻璃板中 排列顺序依次为上层浓缩胶 大孔胶 、下层分离胶 小孔胶 。浓缩胶是核黄素催化聚合而成的大孔胶，分离胶是由AP催化聚而成的小孔胶，T 7．O％～7．5％，C 2.5％。凝胶缓冲液为pH8.9 Tris—HCl，大部分血清中各种蛋白质在此 pH条件下，按各自负电荷量及相对分子质量泳动，此胶主要起分子筛作用。 浓缩效应：由于缓冲体系中pH值选择不一 浓缩胶缓冲液pH6．7，电极缓冲液pH8．3 导致HCl中Cl-几乎全部解离，甘氨酸中仅O.1％～l％解离为NH2CH2COO-，而蛋白质在这种酸碱度中也解离为蛋白质一COO-。这三种带负电荷的离子在电泳时，同时向正极泳动，但泳动率不同。 Cl-离子泳动最快而居先，称“前导离子” 1eading ion ， NH2CH2COO-离子最慢而殿后，称“尾随离子” trailing ion 。这样，在快离子的后面形成一条离子浓度低的低电导区，从而产生较高的电压梯度而加速了蛋白质的泳动。又因蛋白质的泳动率介于快慢离子之间得以被浓缩为一条狭窄的盘形带。 电荷效应：蛋白质在界面上被高度浓缩后，虽形成一条狭带，但因其中每一组分所带荷电量不一，因而泳动率也有差异，这就使其各组分按一定顺序形成若干圆盘。 分子筛效应：当蛋白质夹在快慢离子间通过隔层进入分离胶时，尾随离子由于凝胶的pH值与孔径的突变导致进一步解离而增速以至超过蛋白的泳动率，使高电区梯度不复存在。然而蛋白质在这种均一的电压梯度的条件下，因其各组分的相对分子质量或构型不同，在通过一定孔径的凝胶时，必然受阻程度不同。这种分子筛效应，使之泳动率仍有差异而得以分离。