(09综合实验)壳聚糖微球的制备.docVIP

壳聚糖微球固定木瓜蛋白酶的研究 1 壳聚糖微球的制备 壳聚糖属多糖类物质，是一种生物相容性好、无毒、廉价易得的天然高分子生物材料。壳聚糖易于进行化学改性，引入新的功能团，尤其是壳聚糖分子中含有游离的氨基，通过化学交联剂(戊二醛)很容易与酶发生间接共价结合，使酶牢固地固定在壳聚糖分子上。因此，壳聚糖是一类性能优良的酶固定化载体。 壳聚糖在酸性条件下溶解、碱性条件下沉淀，在较低浓度的NaOH溶液中，壳聚糖微球在还未完全沉淀成球以前就己经塌陷，壳聚糖分子堆砌在一起，导致所成微球形态不好、强度较差、表面厚度不均一、凸凹不平、不能形成良好的结构。随着NaOH浓度的增加，壳聚糖微球迅速成形，容易形成厚度均一、形态较好、韧性好的微球，此时微球表面被撑起，呈现出壳聚糖自身的疏松多孔结构。不过当其浓度达到20%，又不能成球，因为浓度太高来不及成球就己经粘连在一起，形成一片絮状物。所以适宜的NaOH浓度范围为7.5-15%。 在NaOH溶液中加入乙醇后形成的壳聚糖微球更加圆润，而且随着溶液中乙醇含量的增加，壳聚糖微球的机械强度得到了加强，韧性越来越好，但当乙醇浓度达到50%时，球表面产生了很多气泡，微球悬浮在溶液中，不利于操作。 故选取2.0%壳聚糖滴入10%NaOH:乙醇=4:1的溶液中为较好的成球条件。壳聚糖2.0g溶于100mL、1.0%乙酸溶液中((20℃条件下)充分溶解，将壳聚糖溶液逐滴滴入250mL混合液(10.0% NaOH与95%乙醇，体积比为4:1)，得粒度均匀、形状规整的壳聚糖微球，过滤收集壳聚糖微球，再用蒸馏水洗涤至中性，湿态保存。 2 壳聚糖微球的交联： 将1.0g壳聚糖微球置于100mL蒸馏水中，加入一定体积（0.6、1.0、1.4mL）的25%戊二醛，30℃下恒温振荡2.0 hr，用大量水反复洗涤，以去除残留的戊二醛溶液，即得壳聚糖微球载体。 3 木瓜蛋白酶的固定化 称取上述壳聚糖微球载体，加入10mL的0.lmol/L磷酸缓冲溶液(pH = 6.0、7.0、8.0)和10mL木瓜蛋白酶溶液（浓度为：0.5、1.0、1.5mg.mL-1），30℃下恒温振荡一定时间（3.0、4.0、5.0 hr）。弃去上层溶液，用大量水反复洗涤载体，即得固定化木瓜蛋白酶。 4 酶活力测定 在试管中加入1mL的0.lmol/L磷酸缓冲溶液(pH = 7.0，内含5mmol/L半胱氨酸和lmmol/L EDTA) , 3mL 2%酪蛋白溶液( pH= 7.0)，37℃水浴中预5min，然后加入一定量的酶，于37℃反应30min后加入5mL10%三氯乙酸溶液，振荡后于37℃放置1Omin，过滤，测滤液在275nm处的吸光度。空白管则先加入TCA溶液，再加酪蛋白溶液，其余与样品管相同。以上酶活力测定过程中都作三个平行样。 酶活力单位(U)规定为每lOmin内增加0. 1个吸收单位对应的酶量。 5 戊二醛浓度对固定化酶活力的影响 当戊二醛浓度增大时，壳聚糖微球表面上的氨基连接的戊二醛增多，相应地与戊二醛交联的酶分子增多，所以固定化酶的活力增加。但是戊二醛既是固定化反应的交联剂，又是酶的变性剂，会使交联壳聚糖球上的悬挂醛基量提高，固定化过程反应剧烈，悬挂醛基与酶蛋白分子上的氨基发生多点结合，酶分子过多，造成过于拥挤，改变了原有的高级结构，影响酶的活性。而且过量的戊二醛能使壳聚糖分子内的氨基交联，使壳聚糖的孔隙减小，增大了固定化酶的空间位阻。所以导致固定化酶的活力随着戊二醛浓度的增加反而逐渐降低了。 6 加酶量对固定化酶活力的影响 交联后的壳聚糖，其活性基团是一定的，因而在其结合位点未饱和之前，所得固定化酶的活力随加酶量的增加而增大；当结合位点达到饱和后，增大加酶量不能增加固定化酶的活力。 7 pH值对固定化酶活力的影响 游离酶的活性受pH的影响，pH还对酶分子的表面电荷有影响，因此，pH可能对载体和酶的交联反应产生影响。 8 固定化反应时间对固定化酶活力的影响 随着固定化反应时间的延长，固定化酶活力随之增大；当固定化反应完成，载体上的结合位点达到饱和，再延长时间，固定化酶活力不变。 9 固定化条件优化 表一 正交试验因素水平表 因素 水平1 水平2 水平3 A 戊二醛浓度（%） B 酶液浓度（mg/mL） C 交联反应pH D 交联反应时间 0.15 0.5 6.0 3.0 0.25 1.0 7.0 4.0 0.35 1.5 8.0 5.0 表二 正交试验方案与实验结果分析 实验号 A B C D 固定化酶活力 固定化酶活力回收率 1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 极差R 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 1 2 3 3 1 2 2 3 1