毛细管电泳讲述.ppt

* 第二十章 毛细管电泳法 capillary electrophoresis 陈睿婷 一、概述 电泳: 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象。由于不同离子所带电荷及性质的不同，产生差速迁移，可实现分离。 蒂塞利乌斯于1937年设计制造界面电泳仪，成功用于血清蛋白的分离，创建了电泳技术，并因此荣获1948年诺贝尔化学奖。 经典电泳法散热差，难以克服高电压引起的焦耳热，限制了高电压的使用，分离电压受到限制。 1981年，乔更森和鲁卡斯采用75μm内径的石英毛细管做为分离室，紫外柱上检测的方法，在30kv的分离电压下分离丹酰化氨基酸，柱效达到40万个理论塔板。他们的工作为毛细管电泳的发展奠定了基础。 毛细管电泳 怎么减小焦耳热？ 毛细管电泳 毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： 1、采用了几十微米小内径的毛细管； 2、采用了高达数千伏的电压。 由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大，易于散热，因此可减少焦耳热的产生，可采用高压电场，电压升高，电场推动力大，可进一步使柱径变小，柱长增加，柱效增加，理论塔板数高达几十万块/米。 毛细管电泳(CE)：是指离子或带电粒子以毛细管为分离室，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异，实现分离的液相分离分析技术。 毛细管电泳基础理论 石英毛细管柱内壁的硅羟基（等电点为1.5左右），在pH3的缓冲溶液中发生电离，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。 在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，形成电渗流（EOF）。 1、电渗和电渗率 电渗速度uos以下式表示： CE中电渗流的方向 电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极； 内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； 在大多数水溶液中，石英毛细管带负电荷，电渗流流向阴极； 改变电渗流方向的方法： （1）毛细管改性 表面键合阳离子基团； （2）加电渗流反转剂 加入大量的阳离子表面活性剂， 将使石英毛细管壁带正电荷。 缓冲液pH对电渗流的影响随着pH的增大，石英管壁表面的硅羟基解离度增加，界面有效电荷密度增大，EOF随之增大。在缓冲液中加入有机添加剂，如甲醇、异丙醇等，或水溶性高分子物质，对EOF有较显著的抑制作用。 阳离子型的表面活性剂使电渗流发生反转 增大阳离子表面活性剂的浓度，在毛细管柱表面形成双分子层，使电渗流反转. HPCE中电渗流的流形 电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）； 液相色谱中的溶液流动受压力驱动，液固表面摩擦力导致压力降低，为抛物线流型的层流，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。 这是毛细管电泳分离柱效高于HPLC的原因之一。 2、电泳和电泳淌度 电泳（electrophoresis）是指溶液中带电粒子（离子）在电场中定向移动的现象。 电泳迁移速度 uep 为： 式中 －电泳迁移率（电泳淌度） V－毛细管柱两端施加的电压, L－毛细管柱长 在空心毛细管中一个粒子的淌度可近似表示为： 　　 三、表观淌度 表观淌度 表观迁移速度 正离子 μeff+μos ueff+ uos 中性分子 μos uos 负离子 μeff-μos ueff - uos 由于电渗流速度大大高于电泳速度，一般为电泳的5-7倍，所以，不管正离子、负离子还是中性分子，均随电渗流移动。 结构与流程 主要由高压电源、缓冲液及进样系统、毛细管柱、检测器及数据处理等五部分组成 。 毛细管电泳仪 2.主要部件 （1） 高压电源 （1）0～30 kV 稳定、连续可调的直流电源； （2）具有恒压、恒流、恒功率输出； （3）电场强度程序控制系统； （4）电压稳定性：输出精度高于1%； （5）电源极性易转换。 （2） 毛细管柱 （1）材料：玻璃、聚四氟乙烯、熔融石英：化学、电惰性，透紫外、可见光。 （2）规格：内径25～75μm，外径350～400μm；长度30-70cm。 仪器接地，漏电保护， 铂丝电极（0.5-1mm） 进样系统 毛细管柱内体积小，进样量为毛细管长度的1%～2%；纳升级、采用无死体积进样，毛细管直接与样品溶液接触