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实验四 阻断酶联免疫吸附试验（阻断ELISA) 免疫标记技术 定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP 免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA) 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP) 特点： 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类： 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) （1）利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接。 （2）通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。 测定的对象可以是抗体也可以是抗原。 直接法（direct ELISA）： 将已知抗原直接吸附于载体，加酶标抗体 检测抗体 间接法（Indirect ELISA）： 将已知抗原吸附于固相载体，加酶标记二抗 检测液相中未知抗体 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原 竞争法（Competitive ELISA) ： 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体 阻断法（Block ELISA) ： 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记单克隆抗体 检测液相中的可溶性抗体 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 实验材料 猪伪狂犬病毒（PRV） —— 抗原 阴性对照 阳性对照 样品 —— 待测猪血清 HRP标记猪PRV单抗—— 酶标单抗 包被缓冲液：0.025M pH9.6碳酸盐缓冲液 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS 底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 底物溶液：TMB（四甲基联苯胺） ，底物缓冲液，30% H2O2，新鲜配制 酶标板，酶标仪 实验方法 实验方法 具体操作步骤 1、取已包被猪伪狂犬病毒抗原的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释液（PBS）将待检血清1∶1稀释后加入板孔中，每孔加100μl。同样1∶1稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设1孔，每孔100μl。另设一空白对照孔，空白对照孔加100μl稀释液。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃温育30分钟。 2、洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200μl，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3次。 3、每孔加酶标单抗100μl，置37℃温育30分钟。 4、洗板：洗涤3次（方法同步骤2）。切记每次在干吸水纸上拍干。 5、显色与终止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50μl)，混匀。室温（18-25 ℃）避光显色10分钟后。 6、终止：每孔加终止液1滴(50μl) （0.25% 氢氟酸），终止反应。 7、10分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。检测样本的OD值≥0.35为阳性 8、结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630值与阳性对照孔平均OD630值之差≥0.4。 S=样品孔OD630值，N=阴性对照孔OD630值 如果S/N比值≤0.6，样品判定为PRV抗体阳性。 如果S/N比值≤0.7但 0.6，样品重测。 如果S/N比值 0.7，样品判定为PRV抗体阴性 预期结果 阴性：显色为蓝色 阳性：无色 注意事项 1、ELISA实验前血清样品尽量做到37℃灭活30分钟。 2、在ELISA的整个操作过程中，洗涤是不可缺少的重要步骤，每加一层反应结束后均要洗涤固相载体反应板，目的在于防止重叠引起非特异性吸附。洗涤过程中的助溶剂吐温20具有降低非特异吸附的作用。洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质，用力甩干。 3、加入底物液后应该室温避光，结果判断须在10分钟内完成。 “备”则“倍” 有准备、有规划的人生更精彩！ * 用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。 1.定义 2.原理 3.常用种类 （1）? 直接法测定抗原 A.????? 将抗原吸附在载体表面； B.????? 加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物； C. 加底物。底物的降解量＝抗原量。 （2）间接法测定抗体 A.????? 将抗原吸附于固相载体表面； B.????? 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; C.????? 加酶标抗体； D.