STAT3靶向短发夹RNA干扰重组载体对结肠癌SW480细胞.docVIP

STAT3靶向短发夹RNA干扰重组载体对结肠癌SW480细胞 　　【摘要】目的 探讨STAT3基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒对结肠癌SW480细胞STAT3基因的干扰作用。方法 根据siRNA设计原则，构建靶向STAT3基因的短发夹RNA干扰质粒(pGPU6/GFP/STAT3),使用脂质体法转染人结肠癌细胞系(SW480)，通过RTPCR和 Western 印迹检测结肠癌SW480细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平。结果 pGPU6/GFP/STAT3重组质粒经限制性内切酶酶切及测序证明基因插入正确。质粒成功转染SW480细胞后，该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达明显下降(P0.05)。结论 成功构建靶向STAT3基因的shRNA表达载体，转染SW480细胞，能有效抑制细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达，为STAT3基因靶向治疗提供前期的实验依据。 　　【关键词】 结肠癌;STAT3;RNA干扰;基因表达 　　信号传导及转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)是转录信号传导子与激活子家族(STAT)的重要成员，是研究干扰素(IFN)信号转导机制的过程中发现的一种转录因子，可以在外界信号的刺激下激活并直接转入细胞核内引发相应靶基因的转录。近年来研究发现，STAT3是EGF，IL6/JAK，Src 等多个酪氨酸激酶信号通道汇聚的焦点,具有强烈的抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用，参与了人类恶性肿瘤的发生、发展过程,在多种肿瘤中都有过度激活〔1～6〕。目前，研究表明结肠癌细胞系SW480和HCT116增殖过程中STAT3蛋白表达与活化过程增强，提示STAT3过度表达和持续活化可能与结肠癌的发生、发展有关〔7〕。因此，本实验设计和构建针对STAT3基因表达的短发夹RNA(shRNA)重组质粒，转染结肠癌SW480细胞，观察重组质粒对细胞mRNA和蛋白表达的抑制作用，以期为结肠癌的基因靶向治疗提供新的靶点和为进一步的实验研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 人结肠癌细胞株SW480细胞购自中山肿瘤细胞库;胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司;RPMI1640培养液购自莱德尔公司;质粒pGPU6/GFP/Neo、大肠杆菌DH5Α为上海吉玛公司产品;Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒和trizol试剂购自Invitrogen公司;各种工具酶购自Fermentas公司;STAT3单克隆抗体购自Abcam公司;PCR引物和shRNA表达载体插入片段的寡核苷酸链由上海吉玛公司合成;STAT3 shRNA表达载体测序由上海英俊生物有限公司完成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 shRNA表达载体的设计及合成 根据NCBI提供的人类STAT3基因结构(Gene ID：6774)和shRNA的设计原则，参考相关文献选取特异性序列为干扰作用的靶点〔8〕，设计合成4个可干扰序列，并设计一条经BLAST检索与现有基因文库中所有人源基因均无同源性的非特异性序列为阴性对照序列。shRNA模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5′端添加了CACC，与BbsⅠ酶切后形成的黏端互补;反义链模板的5′端添加了GATC，与BamHⅠ酶切后形成的黏端互补;如果siRNA的第一个碱基不是G，则在CACC后补加一个G。 　　STAT31正义：5′CACCGCAGCAGCTGAACAACATGTTCAAGAGACATGTTGTTCAGCTGCTGCTTTTTTG3′;反义：5′GATCCAAAAAAGCAGCAGCTGAACAACATGTCTCTTGAACAT 　　GTTGTTCAGCTGCTGC3′;STAT32正义：5′CACCGAGTCAGGTTGCTGGTCAAATTCAAGAGATTTGACCAGCAACCTGACTTTT 　　TTTG3′;反义：5′GATCCAAAAAAAGTCAGGTTGCTGGTCAAATCTCTTGAATTTGACCAGCAACCTGACTC3′;STAT33正义：5′CACCGCATCTGCCTAGATCGGCTATTCAAGAGATAGCCG 　　ATCTAGGCAGATGTTTTTTG3′;反义：5′GATCCAAAAAACATCTGCCTAGATCGGCTATCTCTTGAATAGCCGATCTAGGCAG 　　ATGC3′;STAT34正义：5′CACCGGCGTCCATCCTGTGGTA