Southern blot(自总结2).docVIP

Southern blot （J 版） 1. 提取植物总DNA (CTAB法) 试剂： 1) 2×CTAB提取缓冲液（低于15℃会析出，加入材料前先65℃预热） 0.1 mol/L Tris-Cl (pH 8.0) 1.4 mol/L NaCl 20 mmol/L EDTA (pH 8.0) 20 g/L CTAB （2%） 20g/L PVP-40（2%） 使用前加入2% (体积比) 的巯基乙醇。 步骤： 提取前将植物材料在暗处放置24小时，以降低材料的淀粉含量。 剪取大约1g 叶片，置于研钵中，倒入液氮研成粉末（一定研磨细致，非常重要），分装入2ml离心管中（样品约占0.5ml的体积），每管加入900ulCTAB提取缓冲液，温和彻底的混匀，静置，使裂解彻底。 65℃水浴保温1-1.5小时。 冷至室温后加900ul 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分温和混匀直到叶片粉末由绿转白（水相，酚相混匀成乳状液）。 室温下13,000 rpm离心10 min，吸取上层水相。 取上清（约900ul）再用等体积的 氯仿：异戊醇 (24：1)再抽提一次。 13,000 rpm离心10min。 取上层水相（约700ul），加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA。小心倒出每管中液体，将絮状DNA沉淀收集到一个新的1.5ml EP管中（同一个样品）。 用70%乙醇洗涤沉淀3-5次，每次将沉淀适当浸泡以充分洗涤，最后一次稍加离心，将洗涤液尽量去除干净，通风橱中晾干约10min左右（不要过分干燥）。 加200ul灭菌的去离子水（或者TE），并加入2ul Rnase A（10mg/ml）， 37℃保温30-60min溶解沉淀，充分混匀，并消化RNA。（可直接到第11步） （可省步骤）如需做此步骤，则上步中需用700ul ddH2O溶解沉淀，37℃保温消化RNA后再用等体积氯仿：异戊醇 (24：1)抽提，并离心，取上清。 加入1/10体积的NaAC（3M，pH5.2）和2-2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min-1hr，10000rpm离心10分钟。 70%乙醇洗涤沉淀3-5次，干燥，用200ulTE溶解沉淀，4℃溶解过夜。 取2ul走0.7%的琼脂糖凝胶，检测所提DNA的质量。（上样DNA需要充分混匀） 电泳同时可用紫外分光光度计测量DNA的纯度，浓度（仅参考）。 选取有代表性的2-3个DNA样品（即电泳显示浓度最大和最小的样品），稀释10倍后用精定量marker进行电泳定量。 A260/A280=1.8 A260/A230=2-2.5 2. 制备地高辛标记探针（详见kitII P9） 试剂： double distilled water(ddH2O)：稀释DNA EDTA(0.2M， pH8.0 )：终止标记反应 DIG-High Prime (kit)：瓶1，防止反复冻融（-20℃保存） 目的基因探针标记(随机引物法)：20ul体系 1ug (至少300ng)模板DNA，用无菌ddH2O稀释到16ul。 沸水浴煮10min，立即放入冰中。 混匀DIG-High Prime （瓶1），加4ul到变性DNA中，混匀，稍加离心。 37 ℃反应过夜（约20小时）。 加入2ul 0.2M EDTA（Ph8.0）或65℃ 10min 终止反应。 Marker探针标记 (随机引物法)： 取3ug (DNA/HindIII Marker，用无菌水将体积补到16ul，沸水浴中煮10min，立即放入冰中。其他同上。 探针标记效率的评估（对探针定量）：（Kit P12） 试剂： Washing buffer：洗去未杂交的抗体 马来酸 buffer：稀释封闭液 检测buffer（pH9.5）：调节pH值 10×Blocking solution（kit ，瓶6） ：用马来酸 buffer稀释到1×。（现配现用） Antibody solution（kit）：每次使用前需要将anti-digoxigenin-AP（瓶4）以10000rpm离心5min，然后小心从上层取需要量，用blocking solution以1：10000的比例稀释。 eg.可取1ul稀释到10ml。 直接检测方法估计探针标记效率： 一系列稀释度的DIG标记探针直接点在膜上，同时一系列已知稀释度的DIG标记的对照探针也点在膜上，通过标准检测过程显示出来。（具体操作步骤见Kit） 3. 酶切 植物总DNA的用量一般为5-15 (g （例如水稻约为5ug, 兰花和烟草约为12-15ug），选用在目的基因内无切点或有单一切点的酶进行酶切。同时切质粒作为正对照，切未转基因的植物材料的总DNA作