分子生物学常用技术讲述.ppt

第二十一章 常用分子生物学技术的原理及应用 The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application 第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization Blotting Technology 原位杂交技术可分析基因在染色体上的位置 原位杂交（in situ hybridization,ISH）是利用分子杂交技术对基因在染色体上定位的一种技术。 基本程序是细胞或组织固定→预杂交→杂交→冲洗→放射自显影或标记酶显色→分析结果。 原位杂交的特点是杂交在显微镜载玻片上中期染色体标本上进行。 荧光原位杂交（FISH）是一种非放射性原位杂交方法，用特殊荧光素标记核酸（DNA）探针； 已有多重原位杂交，分辨率可达100～200kb. 第 二 节 聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction 三、几种重要的PCR衍生技术 （一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术 第 三 节 核 酸 序 列 分 析Nucleic Acid Sequence Analysis 基 因 文 库Gene Library 第五节 基因芯片 基因芯片是指将大量基因探针分子固定在支持物上，然后与标记的样品基因进行杂交，通过杂交信号强弱判断靶分子的数量 蛋白质芯片主要是指蛋白质如抗原或抗体在载体上的有序排列，依据蛋白质分子、蛋白质与核酸相互作用原理进行杂交、检测和分析。 1983.4 Kary Mullis在开车前去北加利福尼亚红树县Redwood country的一条被月光笼罩的山路上构思了PCR 随后卖给了Roche公司 价格：10.000$ 1993 Nobel prize 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ 二、PCR体系基本组成成分 三、PCR的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C （一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）参与基因突变分析的检测 四、PCR的主要用途 PCR诱变 在引物中引入非配对碱基，通过PCR引物可以在扩增产物中引入点突变， 目的基因1 目的基因2 内参actin 1 2 3 4 采用PCR技术也可以分析基因拷贝数 RT-PCR分析基因转录水平的变化 逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT－PCR）又称RNA－PCR。 逆转录PCR Reverse transcriptase-PCR AAA(A)n 5‘-Cap mRNA (dT)12~18 primer anneal 5‘-Cap AAA(A)n 3‘ 5‘ Reverse transcriptase dNTP 5‘-Cap AAA(A)n 5‘ cDNA:mRNA hybrid Regular PCR Fig RT-PCR 内参 1、作定量分析时需要内参 2、常用的有actin、G3PDH等 实时PCR技术原理 目 录 核酸序列分析的基本原理 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (sanger法) DNA链末端合成终止法 ddNTP dNTP 目 录 三、DNA自动测序 采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 DNA自动测序结果举例 目 录 第 四 节 基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库 (cDNA library) 基因文库 (gene library) 是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。 基因组DNA文库（genomic DNA library） 将某一基因组DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称为G文库 cDNA文库(cDNA library)： 以某种细胞的全部mRNA为模板，利用逆转录酶合成与mRNA互补的DNA（cDNA）再复制成双链cDNA,与适当的载体连接后转化入受体菌，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA