snp分子标记作业摘要.pptVIP

、 SNP 的概念 单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。 它包括单碱基的转换、 颠换、 插入及缺失等形式。 SNP 的特点 （1）密度高　SNP在人类基因组的平均密度估计为 1\1000 bp , 在整个基因组的分布达 3×106个。 （2）富有代表性　某些位于基因内部的SNP 有可能直接影响蛋白质结构或表达水平, 因此, 它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。 （3）遗传稳定性 与微卫星等重复序列多态性标记相比, SNP 具有更高的遗传稳定性。 （4）易实现分析的自动化　SNP标记在人群中只有两种等位型(allele) 。这样在检测时只需一个“ + \- ”或“全\无”的方式,这使得基于SNP的检测分析方法易实现自动化。 SNP的检测方法 基于以下9 种基本原理: 以结构为基础; 1.1 限制性片段长度多态性法 （RFLP ）; 1.2 单链构象多态性法 （SSCP ）; 1.3 变性梯度凝胶电泳 （DGGE ）; 等位基因特异PCR（AS-PCR）; RT-PCR; 等位基因特异性杂交; 引物延伸法--单碱基延伸法; DNA直接测序法; 飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测; 变性高效液相色谱 ( DH PLC )法； 引物筛选 * 单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。 SNP 是指在染色体基因组水平上单个核苷酸的变异引起的DNA 序列多态性, 而其中最少一种等位基因在群体中的频率不小于 1%。 [2 ]。例如, 一个SN P 可以将一个DNA 序列: AA GGCTAA 变为A TGGCTAA ,其中发生了A→T 的颠换。 SNP分子标记的原理及应用 案例：基于ＳＮＰ分子标记的凹叶木兰遗传多样性初步研究 技术路线： 1、采样，材料准备 2、基因组DNA提取 3、引物的获取与筛选 4、ＰＣＲ扩增及目的片段回收 5、连接、转化与测序 6、分析方法 7、结果分析 1、采样，材料准备 研究所用的２９个凹叶木兰个体的嫩芽样品（表１）于２００７年分别随机采自四川雷波县麻咪泽省级自然保护区（２２个）和美姑县美姑大风顶国家级自然保护区（７个）。样品采集后即置于有硅胶的密封袋中保存，防止DNA降解。引物筛选所用正对照杨树叶片采自四川大学望江校园内。 2、基因组DNA提取 基因组ＤＮＡ 采用大连宝生（ＴａＫａＲａ）公司的Ｇｅｎｏｍｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＤＮＡ 提取试剂盒分批提取。对所提取的基因组ＤＮＡ 标号，贮存于－２０℃冰箱中备用。 3、引物的获取与筛选 3、1引物来源 美国加州大学戴维斯分校实验室从ＮＣＢＩ的毛果杨ｕｎｉＧｅｎｅ数据库中下载了毛果杨的单基因序列，并将其与拟南芥基因序列对比，发现其中一段共有序列。由于毛果杨（杨柳科）与拟南芥（十字花科）为系统位置跨度很大的两种植物，该段序列共有的现象说明了此段序列具有高度的保守性，故推断在凹叶木兰的基因序列中也应存在该段序列。 3、2引物设计与选择 Ｍｉｎｇｃｈｅｎｇ　Ｌｕｏ实验室为这一研究设计出２２５对引物。在本研究中，随机选取了１０对引物（表２），并从已提取的凹叶木兰样品基因组中随机选择一个作为模板、以杨树模板为正对照，对１０对引物进行复选，最终选定了条带清晰、无杂带的３５６号引物（图１）用于本实验。 4、ＰＣＲ扩增及目的片段回收 引物选定后，以所提取的凹叶木兰基因组ＤＮＡ 为模板，用选定的３５６号引物进行目的片段扩增。由于要对所扩增的目的片段进行测序，为避免Ｔａｑ酶引起的碱基突变而造成测序结果不准确，本实验选用体积比为４∶１的Ｔａｑ酶与Ｐｆｕ高保真酶混合酶。 扩增条件：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性１５ｓ，５０℃ １５ｓ，７２ ℃延伸６０ｓ，循环４０次。ＰＣＲ扩增后，采用Ｏｍｅｇａ胶回收试剂盒对目的片段进行回收，进而进行之后的连接、转化等步骤；对暂时不用回收的产物进行编号并贮存于－２０℃冰箱。 5、连接、转化与测序 由于本实验中的ＰＣＲ产物浓度达不到直接测序的要求，故采用传统的连接、转化、涂板、检测、再测序的方法。 具体过程为：将回收的目的片段连接到ＰＭＤ１９－Ｔ载体中（连接体系见表３），再将连接了目的片段