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微生物数量测定 微生物与免疫教研室 实验目的 明确血细胞计数板计数的原理 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法 了解平板菌落计数法、光电比浊法的基本原理和方法 实验原理 单细胞微生物个体生长时间较短，很快进入分裂繁殖阶段，因此，个体生长难以测定，除非特殊目的，否则单个微生物细胞生长测定实际意义不大。微生物的生长与繁殖（个体数目增加）是交替进行的，它们的生长一般不是依据细胞的大小，而是以繁殖，即群体的生长作为微生物生长的指标。 测定细胞数目的方法 显微镜直接计数法（Direct Microscopic Count）、 平板菌落计数法（Plate Count）、 光电比浊法（Turbidity Estimation by Spectrophotometer）、 最大或然数法（Most Probable Number MPN） 膜过滤法（Membrane Filtration）等 显微镜直接计数法 显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。 目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Petoff-Hausser计菌器以及Hawksley计菌器等。 用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。 血球计数板结构 实验材料 酵母菌悬液 血细胞计数板 显微镜 毛细吸管 实验步骤 1、菌悬液制备：以无菌生理盐水制备成适当浓度的菌悬液 2、镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有异物，则需清洗，吹干后才能进行计数。 3、加样品：将洁净干燥的血细胞计数板上盖上盖玻片，再用毛细吸管将摇匀的菌悬液在盖玻片边缘滴加，靠毛细渗透作用自动进入计数室。 4、显微镜计数：加样后静置一会，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室，再用高倍镜进行计数。（要求每个同学都要计数，数三次取平均值） 5、清洗血细胞计数板：使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿应硬物刷洗，洗完后自行晾干或者吹风机吹干。需镜检是否洗净。 计数时，通常取中间大方格的五个中方格进行计数，即四角的四个中格和中央的一个中格。 在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度再在计数，一般样品稀释度要求每小格内约有5-10个菌体为宜。 实验结果 计数5个中格的平均值，然后求得每个中格的平均值。乘上25就得出计数区总菌数，最后再换算到1mL菌液中的含菌数。 1ml菌液中的总菌数 =每中格平均菌数×25×104 ×稀释倍数 注意事项 保证计数板和盖玻片的清洁，操作中勿让手接触计数板表面，以防污染，致使充池时产生气泡。 一次完成充池，如果充池过少，过多或有气泡，应洗净计数板后重新充池。 平放计数板，不能再充池后移动盖玻片。 计数池内如细胞分布严重不均，应重新充池。 思考题 在显微镜下直接测定微生物数量有什么优缺点？ 平板菌落计数法 待测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，有每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即为一个CFU，统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。 平板计数法虽操作比较复杂，结果需要培养一段时间才能取得，测定结果易受多种因素的影响，但是该方法可以获得活菌的信息，广泛用于生物制品检验，以及食品、饮料和水等的含菌指数或污染程度的检测。 实验方法 1、编号：取平板9块，分别用记号笔标明 10-1、10-2 、10-3 （稀释度）各3套。另取6支盛有4.5 mL无菌水的试管，依次标示10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。 2、稀释： 3．取样、涂布：用三支lmL无菌吸管分别吸取10-1、10-2、10-3的稀释菌悬液，对号放入编好号的平板中，每个平板放0.2mL。用无菌三角涂布棒将菌液涂布均匀，每个浓度三个重复。 4．培养：待菌液完全干后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。 5．计数：培养37℃恒温培养箱24h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数。 实验结果 计算同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按照下列公式计算 每毫升中菌落形成单位（cfu/ml）=同一个稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5 计数细菌、放线菌、酵母菌以每平皿30-300为宜；霉菌以每平皿10-100个菌落为宜。 三、光电比浊计数法 当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射和吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度和透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出。 该法简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。但是，由于菌体浓度受多种因素影响。因此对于不同微生物的菌悬液进行光电比浊计数应采