外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测-jgh解析.pptxVIP

实验九 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测 一．实验目的 1．通过本实验掌握外源基因在原核细胞中表达的特点和方法； 2．掌握SDS的制备及其分离原理。 二．实验原理 本实验介绍一种常用的表达载体――pET载体系统。在pET系列载体中，外源基因的表达受T7噬菌体RNA聚合酶的调控，这类载体是Studier等于1990年首先构建的，后来得到很大发展。它们的典型特点是带有pBR322的大肠菌素E1 (colEl)复制区。从而赋予宿主菌氨节青霉素或卡那霉素抗性。在这些载体中，编码序列在多克隆位点插入，置于天然T7 RNA聚合酶启动子(φ10启动子)或所谓的T7 lac启动子的控制之下，后者是带有lac操纵子( larO)序列的天然T7 RNA聚合酶启动子的衍生体。lac阻抑物的结合能阻断转录起始。 将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30a表达载体（如图1）中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖 )，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达，表达蛋白可经SDS检测。 SDS分离蛋白原理 组成蛋白质的氨基酸在一定pH的溶液中会发生解离而带电，带电的性质和带电量的多少取决于蛋白质的