第6章_常用分子生物学技术剖析.ppt

1、基因芯片 基因芯片应用 可在基因组水平进行基因表达和发现研究、突变、序列测定等，已方泛应用于基因组研究和人类疾病的诊断等多领域。 2、蛋白质芯片 蛋白质芯片技术在医学中的应用 特异性抗原抗体的检测 生化反应的检测 疾病诊断 对疾病分子机制的研究 药物筛选及新药的研制开发 3、细胞芯片 4、组织芯片 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 化学合成法主要应用 作为核酸分子杂交探针 作为引物，用于测序和PCR 用于制备小的基因、不易获得基因或用于改造天然基因 作为DNA末端改造中的接头 用于制备cDNA，筛选克隆基因，或基因定位或基因的定点突变 如何敲除其胰岛素基因，成为糖病模型？ Holliday模型的4个关键步骤： 两个同源染色体DNA排列整齐； 思考题 核酸分子杂交技术分为哪几种类型？各自特点？ 什么是探针？ 什么是基因芯片？基因芯片的基本特点？ PCR技术的基本原理？ PCR反应体系的成分及功能？ PCR技术的主要用途？ 什么是cDNA文库？哪些优点？ 基因敲除的一般原理？ 基因敲除的选择性标志有哪些？功能是什么? 什么是PNS筛选？ 课后P163的三道题。 2、正向筛选法 正向筛选标记基因Neo具有双重作用，一方面导致了靶基因的插入突变；同时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养?基中生长。 正向筛选法可分为无启动子筛选法、无增强子筛选法和无polyA筛选法。 （1）启动子缺失筛选法 原理是在重组基因载体的目的片段中插入一个启动子缺失的正向选择基因?neo?neomycin，同时，目的基因片段也不包含该基因的启动序列。如果基因载体和细胞基因组发生同源重组，则正向选择基因可以在靶位点基因启动子的作用下?得以表达，使阳性细胞具有?G418?抗性，从而在选择培养基中得到同源重组阳性克隆。 （2）Poly-?A缺失筛选法 Poly-A缺失筛选的载体设计与启动子缺失的设计基本相同，当打靶基因不能被诱导表达时，则考虑选用poly-?A缺失敲除策略。Poly?-?A?缺失的正向选择基因?neo位于载体目的片段中,?由于neo?基因转录终止信号的缺失,其表达受到抑制。在重组阳性细胞中，neo基因通过利用基因组靶位基因的转录终止信号得以表达，使阳性细胞获得?G418?抗性，并得以筛选出来。 3、PCR筛选法 其原理是通过在目的突变基因序列中引入特定的PCR引物序列，利用?PCR方法直接检测转化细胞的?DNA结构，然后根据特定扩增?DNA片段的有无,来鉴别中靶阳性细胞克隆。 HSV-tk PNS置换型载体 × × neo 同源重组 基因组 neo PCR法鉴定ES细胞的引物设计 获得基因敲除纯合体：由于同源重组常常发生在两个等位基因中的一个，所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。 五、基因敲除动物的产生  ?????????????????????????????????????????????????????????????  由嵌合体得到基因敲除的纯合体小鼠 1. ES细胞引入动物体胚胎的方法：显微注射法、胚胎聚合法 和 核移植法。 原核显微注射 ES细胞入胚胎通常用的是E3.5的囊胚，进行的是囊胚显微注射，得到的是嵌合体小鼠 胚胎聚合法：可以得到四倍体细胞 核移植法：可能完全ES来源的动物 2. 带ES细胞的胚胎移植到假孕鼠的子宫内，发育成嵌合体小鼠或ES细胞来源鼠。 3. 嵌合体小鼠或ES细胞来源鼠鉴定 4. 后续：除Neo、回交的问题、 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。 三、化学合成 第三节 基因敲除技术 基因敲除（gene?knock?out）又称基因剔除，或基因打靶?（gene?targeting）是指通过DNA定点同源重组，定向改变基因组中的某一特定基因，使机体特定基因失活或缺失，从而研究此基因的功能的一种分子生物学技术。 由于胚胎干细胞的这种特殊性，ES细胞基因打靶技术已被广泛地应用于建立转基因动物之中。从80年代到90年代初，小鼠ES细胞基因打靶技术已发展到成熟阶段。 1984年，Bradly等成功地用显微注射法将ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，再适当交配，获得源于ES细胞系纯系小鼠。 基因敲除的发展历程 此实验首次证实体外培养的ES细胞能在体内分化发育成生殖系嵌合体并可获得小鼠纯合体子代。1987年，人们利用ES细胞技术建立了次黄嘌呤磷