沙门氏菌（猪霍乱、鼠伤寒）环介导等温扩增检测技术-规范性审查稿.docVIP

ICS11.220 B 41 DB37 山东省地方标准 DB37/T XXXXX—XXXX 沙门氏菌（猪霍乱、鼠伤寒）环介导等温 扩增检测技术 Loop-mediated isothermal amplificationfor Salmonella typhimurium and Salmonella choleraesuis XXXX-XX-XX发布 XXXX-XX-XX实施 山东省质量技术监督局发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业科学院提出。 本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：黄保华、时建立、李俊、彭喆、刘畅、朱荣生、徐绍建、丛晓燕、杜以军、吴家强、孙文博。沙门氏菌（猪霍乱、鼠伤寒）环介导等温 扩增检测技术扩增检测技术 范围 本标准规定了鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis）的环介导等温扩增（LAMP）检测技术的要求。 本标准适用于疑似污染鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌的各种样品检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 4789.4-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 材料 器材 微量移液器（最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL） 20000g低温高速离心机 电热恒温水槽 稳流稳压电泳仪 水平电泳槽 凝胶成像系统 紫外透射反射分析仪 电磁炉 烧杯（1000mL） 试剂 5mol/L Betaine溶液：配制见附录A.1 Bst DNA Polymerase（8U/μL） SYBR Green Ⅰ核酸染料 0.5×TBE缓冲液：配制见附录A.2。 1%琼脂糖电泳液：配制见附录A.3。 10 mg/mL的溴化乙锭（EB）水溶液。 DNA Marker 2000。 超纯水：符合GB/T 6682要求。 引物 鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测引物： F3： 5’- CGATAATTTCATCTTCAATTTCTGG-3’ B3： 5’- CGTGAGATATCGTCCAAAAGG -3’ FIP：5’- GCACTCCGGTTGTAAACCATTATTT-GTACTGAGGCTAATTCACCAC -3’ BIP：5’- AGCGTAAAGCAACTCATTTTTGTT-GTTTGTTTTTGATGATACAGGC -3’ 猪霍乱沙门氏菌LAMP检测引物： F3： 5’- GGAGGAAGGTAGGGATGACG -3’ B3： 5’- CACTCCCATGGTGTGACG -3’ FIP：5’- TCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTT-CCCTTACGACCAGGGCTA -3’ BIP：5’- CGGATTGGAGTCTGCAACTCGA-GGAACGTATTCACCGTGGC -3’ 方法 样品处理及DNA的提取 样品前处理及增菌按照GB 4789.4-2010中5.1 、5.2操作。取1 mL增菌液放入1.5毫升EP管中，10 000 r/min离心2 min，去上清；加入灭菌生理盐水1 mL混匀，10000 r/min离心2 min，去上清；然后加灭菌双蒸水1 mL混匀，，放入沸水浴中煮沸10min，取出后迅速放入冰块中，冷却5min,12000rpm，离心3min,吸上清液作为DNA模板，并保存于-20℃备用。 环介导等温扩增（LAMP）操作流程 环介导等温扩增反应体系配制 按表1中1-8的循序配制。 环介导等温扩增反应体系 1 10×ThermoPol 2.5 μL 2 dNTP混合液10mmol/L) 4.0μL 3 B3/F3(5μmol/L) 0.15 μL×2 4 BIP/FIP(50μmol/L) 1.5 μL×2 5 Betaine(5mol/L) 3.0 μL 6 DNA 1.0 μL 7 Bst DNA Polymerase(8U/μL) 1 μL 8 超纯水 10.2 μL LAMP程序设定 每次LAMP均应设一个阴性对照（用超纯水作为模板），具体参数见表2。 LAMP反应程序设定 温度 时间 ℃ 鼠伤寒沙门氏菌60min 猪霍乱沙门氏菌75min 2 80℃ 5min 电泳操作 1%琼脂糖凝胶板的制备 称取0.6g琼脂糖，加入60mL 0.5×TBE缓冲液中，加热融化，温度降低后加入1%的E