第九章—核酸分子杂交(上)周琳1ppt.ppt

② 显色反应 酶法：通过酶促反应使其底物形成有颜色的反应产物 碱性磷酸酶 辣根过氧化物酶 DAB（二氨基联苯胺）→红棕色 TMB（四甲基联苯胺）→蓝色 第三节 核酸分子杂交技术 印迹杂交 核酸原位杂交 液相印迹杂交 固相杂交 是将电泳分离的待测DNA片段固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的位置上显示杂交信号的方法。 一、传统的核酸分子杂交技术 1、Southern 印迹杂交 提取DNA 限制性内切酶消化 琼脂糖凝胶电泳 碱变性 转移到NC膜，高温烘烤 与DNA探针杂交 放射自显影 基本步骤 预杂交 图 虹吸印迹法 与Southern Blotting不同的是：1. 不需要限制性核酸酶切; 2. 变性方法不是碱变性，而是采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲醛、甲基氢氧化汞等方法。 检测靶分子为RNA RNA极易被环境中存在的RNase 降解，提取时要特别注意RNase 污染问题。 2、Northern 印迹杂交 3、斑点杂交与狭缝杂交 将RNA或DNA变性后直接点样或用狭缝点样器加样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再用探针进行杂交，这样的方法称为称为斑点杂交（dot blotting）或狭缝杂交(slot blotting)。 dot blotting slot blotting 4、Western 免疫印迹 检测蛋白质 * 核酸分子杂交技术Nucleic Acid Molecular Hybridization 主讲内容 核酸分子 杂交 的基本原理 核酸探针 核酸分子 杂交技术 一、DNA的变性（denaturation） 变性：在一定的条件下，DNA双螺旋之间的氢键断裂，解离成两条无规则的卷曲状单链DNA分子，此现象称为变性。 复性：去除变性因素后，单链DNA通过碱基互补配对原则重新结合成稳定的双螺旋结构，这一过程称为复性。 二、DNA的复性 (renaturation) 退火 淬火 根据核酸变性和复性的原理，来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补配对形成异源双链杂交体的过程。 三、核酸分子杂交 杂交的基础：核酸分子单链之间的碱基互补配对。 注：分子杂交可以在DNA与DNA、RNA与RNA、RNA与DNA的两条单链之间进行。 核酸分子的浓度 温度 离子强度 核酸分子的复杂性 影响核酸分子杂交的因素 四、核酸分子杂交技术 通过标记的单链核酸探针与固相支持物上或液相中单链的互补靶序列退火形成双链杂交体，而定性或定量检测特异DNA或RNA的技术。 第二节 核酸探针 核酸探针的概念 核酸探针的类型 核酸探针的标记 核酸探针的检测方法 核酸探针( nucleic probe )：指能够与待测的靶核酸片段互补结合的带有特殊可检测标记的核苷酸片段。 一、概念 按化学本质分： DNA探针 RNA探针 按标记物分： 放射性标记探针 非放射性标记探针 按分子大小分： 寡核苷酸探针 单链探针 双链探针 二、核酸探针的类型 二、常见核酸探针 1.基因组DNA探针 2.cDNA探针 3.RNA探针 4.寡核苷酸探针 来源于某种生物的基因组，为某 一基因的全部或部分序列。 来源于cDNA,不含有内含子序列，适用于基因表达研究。 大多以单链形式存在,杂交效率高。可通过体外转录技术获得。 用化学合成技术在体外合成的单链DNA,长度一般为20-50bp。 三、核酸探针的标记 1.核酸探针的标记物 （1）放射性核素标记物 常用放射性核素标记物有： 32P、35S、 3H 优点：①灵敏度极高,可检测到10-14 ～ 10-18g的物质，在最适 条件下，可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量，光谱分析法只能鉴定10-9g的物质。 ②对碱基配对的特异性和稳定性无影响。 ③特异性高。 缺点：放射性污染，有半衰期。 32P或35S同位素标记的单核苷酸 （α） （γ） （OH）H OH (2)非放射性标记物 优点：无放射性污染，稳定性好，可以较长时间存放， 处理方便。 缺点：灵敏度、特异性不够理想。 常用非放射性标记物有：生物素、地高辛、酶、荧光素 2.核酸探针的标记方法 （一）酶促法