第九章胚胎干细胞ppt.ppt

②骨和软骨疾病 ES和EG细胞具有自我更新的能力，可被培养产生在数量上比从组织得到的多得多的骨和软骨细胞。 受控制的干细胞群落在被移植的受体中，对许多骨和软骨细胞数量不足和功能缺损的疾病起长期补充作用，有希望治疗骨和软骨的遗传缺损和发育异常等骨和软骨疾病。 从ES细胞衍生的骨和软骨细胞在被移植部位自我修复的优点远远超过现行的组织移植。 ③血液病 ε－珠蛋白基因在镰刀状血球病人中被激活时，则能封阻含有镰刀状血球血红蛋白的红细胞被镰状化。 ES细胞及其基因操作可能回答如何在成年镰刀状血球病人中启动ε－珠蛋白基因表达，阻止疾病的进展。 ES细胞和造血干细胞也有助于产生供细胞治疗移植用的、不含有镰状血球突变的血细胞。 ④肝病 通过移植分离的肝细胞可以治疗肝功能严重损伤的病人，然而供者原代肝细胞一般不能在组织培养中增殖。 将人肝干细胞通过转基因导入生长促进基因成为永生化细胞时，可在体外大量增殖，同时保留分化的能力，移植入肝病动物模型，改善动物的肝功能。 但，利用永生化细胞时，却存在着易发生肿瘤的危险。有人提出，给予一种药物激活“细胞自杀”基因，控制在一定数量范围内。 组织工程的种子细胞来源 目前，缺损组织或器官的修复主要有3种方法，即自体移植、异体移植和组织代用品。这3种方法都受到客观条件的限制。 基本的设想是： 选择与人体细胞兼容性较好的生物材料； 按缺损组织或器官的要求设计并制成模型或支架放在体外培养系统中； 使ES细胞或其定向诱导分化细胞沿着模型或支架不断地生长扩增，构建成新的组织或器官。 要在人类临床医学中应用，尚需时日，特别是要解决有效地改造基因组、克服细胞移植中的免疫学障碍、定向诱导分化、细胞纯化、永生化和体外组织构建等一系列复杂问题，多数研究还处在实验室阶段。 同时，有关伦理道德和法律及商业应用等问题尚需规范。 已经证明有可能使ES细胞分化为特殊类型的细胞，作为组织或器官体外生长的重要种子细胞来源。 干细胞应用之优缺点 干細胞来源 优点 缺 点 胚胎干细胞 增生能力强 分化潜力佳 伦理道德之争议 免疫排斥 形成肿瘤的危险性高 成体干细胞 没有伦理道德之争议 2.取自自体，免疫相合 增生能力有限，且随者年龄降低 2.特定分化能力限制 将胚泡接种于预先铺有作为滋养层而无有丝分裂活性的单层MEF细胞的培养皿中 用免疫手术法分离胚泡的ICM细胞，或用常规培养法分离出ICM细胞进一步培养。 培养2－3天 免疫手术法 4－4.5dpc的小鼠胚泡主要由已分化的滋养外层胚层和未分化的ICM细胞组成，前者细胞表面一般已表达主要组织相容性复合体（MHC），能识别其相应抗体和形成免疫复合物，在补体存在时可导致细胞发生免疫溶解。 具体操作如下： 体外培养的胚泡，用酸性Tyrode`s液（pH2.5）处理，去除透明带； Hank`s洗涤，加入兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清（抗H－2b）； 移至含新鲜豚鼠血清的培养液， Hank`s液洗涤后，移至96孔铺有MEF或STO饲养层细胞和DMEM基本培养液的板内进一步培养。 30min 胚泡的滋养外胚层细胞呈泡状，发生免疫溶解；而ICM细胞不具H－2b抗原，细胞完整； 30min 常规培养法 未去透明带的胚泡培养3－4天，ICM细胞团从贴壁胚泡内长出来； 胰蛋白酶和EDTA混合消化液在37℃消化5min； 解离的细胞团移至滋养层的24孔培养板，继续培养4天，可在一些孔内见到巢状胚胎干细胞团； 胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，克隆和纯化ES细胞。 视ES细胞巢密度转移到较大容积的培养皿或培养瓶。 EG细胞的培养过程 哺乳动物原始生殖细胞（PGC）最早发生于近尿囊基部的卵黄内胚层内，随着胚胎发育和纵向转折，卵黄囊的一部分成为胚胎的后肠，PGC取材主要根据其在不同物种的早期胚胎中所处迁移位置而定。 1、原始生殖细胞的分离和原代培养 收集8.5－10.5dpc小鼠胚胎，用D－Hank`s液轻洗后，在解剖镜下用镊子剖取包含原始生殖细胞（PGC）的生殖嵴组织； 以0.02%EDTA液孵育含PGC细胞的生殖嵴组织，37℃,15min； 吸管轻吹打散，接种于铺有滋养层的4孔培养板内。 基本培养液 DMEM液 15%－20% FCS 0.1mmol/L　β－巯基乙醇 50U/ml青霉素、50ug/ml链霉素 2mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠 2、滋养层细胞 宜用8代以内的小鼠MEF细胞或STO细胞系。 用前经10ug/ml丝裂霉素C在37℃处理2－3h； 接种于包被0.1%明胶的培养板或细胞瓶内，培养液为含10%小牛血清的DMEM。 3、EG细胞纯化和建系 培养物在滋养层细胞上分裂