重组质粒原核表达.docVIP

实验九 表达质粒的构建与诱导表达 原核表达概述 基因工程的研究一方面是获得基因的表达产物，另一方面是研究基因结构与功能的关系，最终都涉及目的基因的表达问题。表达载体（express vector）是指本身携带有宿主细胞基因表达所需的调控序列，能使克隆的基因在宿主细胞内进行转录与翻译的载体。也就是说，克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞内扩增；表达载体不仅使外源基因扩增，还使其表达。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用。外源基因在宿主（受体）细胞内是否表达以及表达水平受到许多因素（调控元件）的制约： 1．正确的阅读框架 为了获得正确编码的外源蛋白，外源基因编码区在插入表达质粒中原核基因编码区时，阅读框架应保持一致。阅读框架是由每三个核苷酸为一组连接起来的编码序列，外源基因只有在它与载体DNA的起始密码相吻合时，才算处于正确的阅读框架之中，从而表达融合蛋白，使外源蛋白与宿主蛋白相融合。 2．目的基因有效转录的启动子 启动子(promoter) 是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列， 它是基因表达不可缺少的重要调控序列。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成的，分别称为 一35区和 一10区。一35区的序列为TTGACA，一10区序列为TATAAT。此两序列之间的最佳间距为17 bp。可与RNA聚合酶结合，并指导该酶在正