6DNA重组技术摘要.pptVIP

本章主要内容 DNA重组技术相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 DNA重组技术的基本过程 DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种遗传物质(DNA)与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子—复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量DNA分子，即DNA克隆（基因克隆，重组DNA） 本 章 结 束 * * 第十三章 DNA重组技术 DNA Recombination Technique 一、DNA重组技术相关概念 （一）DNA克隆 克隆（clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的组合。 获取同一拷贝的过程为克隆化（cloning）,即无性繁殖。 基因工程 实现基因克隆所采用的方法和相关的工作。 生物技术工程 基因工程、蛋白质工程、酶工程和细胞工程统称。 （二）DNA重组技术常用的工具酶 50年来，核酸酶学的进步为DNA的分析与鉴定提供了有力的工具。 主要的核酸酶有： DNA聚合酶（DNA polymerase ） klenow 片段， Taq DNA聚合酶 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ） 逆转录酶（Reverse transcriptase） S1核酸酶（ S1 nuclease） 连接酶（Ligase） 拓扑异构酶（Topoisomerase）等 1、限制性核酸内切酶 概念：是一类特异性地水解双链DNA的磷酸二酯酶． 限制性内切酶（有专一的切点并常在切口处留下黏性末端） 命名： 按酶的来源的属．种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作喀语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字． 例如：从流感嗜血杆菌d株(Hocmophilu9 inrlucn：ac d)中先后分离到3种限制酶，分别命名为HindI，HindII和HindIII· 3、载体 能将外源基因DNA带入宿主细胞并能复制或最终使外源基因DNA表达的自主DNA，称为载体(vector)。 常用的载体 1）大肠杆菌的质粒(plasmid)DNA 2）噬菌体DNA 3) 病毒DNA 质粒 是一种环状双链的DNA分子.自身在细菌细胞中能不断复制繁殖,质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌，这个过程称转化。转入的质粒DNA仍能进行复制，这种性能为DNA重组技术提供了重要的条件，即将一种外源基因与质粒重组后，再转入细菌中去复制繁殖，使外源基因得以增殖。 二、DNA重组技术的基本过程 克隆基因载体的选择与构建（切） 目的基因与载体的连接 重组DNA分子导入受体细胞（转） DNA重组体的筛选与鉴定（筛） （接） 目的基因的获取（分） 1）化学合成 2）制备的基因组DNA 3)cDNA 4）PCR技术 5)基因文库 G文库：用基因组的总DNA制备 cDNA文库：用细胞全部mRNA经反转录制备全套cDNA后建库。 1、目的基因的来源 2、克隆基因载体的选择与构建 3、目的基因与载体的连接 平端连接： T4DNA连接酶可催化相同或不同内切酶切割的平端连接，但效率较低． 同聚物加尾连接 用末端转移酶添加DNA的3‘末端，人工形成能互补的共核苷酸多聚物粘性末端。 4、重组DNA分子导入受体细胞 1)转化：由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化。采取一些方法处理细胞．经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为感受态细胞：再与外源DNA接触，就能提高转化效率。 2)转导：通过噬菌沐或病毒的感柒作用将一个细胞的遗传信息传递到另一个细胞的过程．用噬菌体活病毒作载体，以其DNA与目的序列重组后，在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒。就能以感染的方式进入宿主细菌或细胞，使目的序列得以复制繁殖 3)转染：重组的噬菌体DNA也可象质DNA的方式进入宿主菌，即宿主菌先经过CaCl2等处理成感受态细菌再接受DNA，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖。这种方式称为转染．用人工