实验八 总RNA提取和反转录.pptVIP

* * 实验八 总RNA提取和反转录 实验目的： 1.掌握TRIZol试剂法提取细胞总RNA的原理和实验步骤； 2. 掌握反转录（RT）的基本原理和操作步骤。 总RNA提取 反转录 （RT） 聚合酶链式反应 （PCR） 检测目的基因的表达： 通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，样品分成水样层和有机层，RNA存在于水样层中。收集水样层后，通过异丙醇沉淀RNA，再经过洗涤、晾干、最后溶解等步骤即得到相对较纯的RNA。 反转录是在反转录酶的作用下，以总RNA中mRNA为模板合成cDNA的过程。 实验原理： 1．TRIzol试剂：主要成分是苯酚，它能裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚并得到释放。此外，TRIzol中还有8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。 2．氯仿：与酚一起作用，使蛋白质变性；抽提水相中残留的酚，减少RNA损失。 3．异丙醇：沉淀核酸。 4．75℅乙醇（DEPC水配制）：去除RNA沉淀中的盐分。 试剂的用途： 实验步骤： 1. 取1/3小鼠完整肝组织（约1g），直接加入4mL TRIzol试剂。用匀浆器进行匀浆处理，室温放置5分钟,每组取0.5mL 。 2. 加入0.1mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min。 3. 10000rpm离心5min，RNA主要在上层水相中。