核酸的提纯与质量鉴定1重点.pptxVIP

核酸的提纯与质量鉴定 我们需要提取什么核酸？ DNA RNA 基因组DNA 质粒DNA 总RNA mRNA microRNA 我们需要做什么？ 样品准备 核酸提取、纯化 质量鉴定 样品保存 质粒DNA提取 小量质粒DNA提取（ ～ 10 µ g） 主要用于分子克隆相关操作。 中等量质粒DNA提取(几十到几百µ g) 主要用于细胞转染实验。 含有质粒宿主菌的液体培养（LB+抗生素） 菌体收集 菌体裂解 质粒纯化（硅胶膜、或离子交换树脂等） 基本分离原理 最为典型的小抽和中抽操作步骤 纯化中使用的各种溶液配方 注意事项 LB：酵母抽提物，胰蛋白胨质量，pH一般在6.8-7.4间就行。 抗生素种类，浓度 培养时间37℃,12-16h; 个别宿主菌和质粒可能需要其他温度培养。 质粒拷贝数高低 缓冲液P1中是否加入了RNase A 离心收集菌体不要过实，造成重悬困难 中抽裂解液要充分离心去除沉淀，以免堵柱子。 洗涤缓冲液中是否加入建议浓度的乙醇。 异丙醇沉淀出质粒干燥时要适度，不要不干，不要过干。 DNA定量 Nanodrop 微量分光光度计 校零缓冲液与溶解质粒的相同。 1 OD(260nm)=50 µg/ml DNA 纯度：OD(260nm)/OD(280nm)在1.6-2.0之间。 如﹤1.6可能有蛋白质污染；﹥2.0可能有RNA污染。 电泳分析 基因组DNA的提取 根据用途选择方法 PCR: 根据要扩增的片段长短和扩增难度选择提取方法。 如果建库，做基因组测序，酶切或做Southern选择质量高的方法提取。 讲解实例 动物细胞、组织中基因组DNA提取 全血中基因组DNA提取-试剂盒法 样品准备 新鲜细胞、血液、组织 低温冷冻样品（液氮或-80℃） 特别注意：全血最佳保存条件是4-8 ℃，深低温冻存前要先裂解红细胞。 粗提法（500bp PCR） 硷裂解法 缓冲液配方：A:0.1M或0.2M NaOH; B:0.02M或0.04M Tris-HCl pH7.5-8; 1-10万细胞，或组织50-100µg, 加入20µl A 90°C 30-60min, 180µl B中和，2-5 µl用于50µl体系PCR 酶法 提取缓冲液配方：10 mM Tris pH8，2 mM EDTA，0.2% Triton X-100，200 µg/ml Proteinase K，RNase 50 µg/ml 1-10万细胞，或组织50-100µg,加入50-100µl 缓冲液， 50-56°C 2-3 hrs ，煮沸5-10min，冰浴冷却， 10-15 µl用于50µl体系PCR. 完整基因组DNA提取(以Promega Wizard Genomic DNA purification kit 为例) DNA得率与材料量间的关系 试剂盒组成及自备试剂 自备：异丙醇和70%乙醇，用高压灭菌的Milli-Q水配制 操作步骤 基因组DNA的鉴定 不同浓度琼脂糖分离DNA的有效范围 (kb) 0.3……5-60 0.6……1-20 0.7……0.8-10 0.9……0.5-7 1.2……0.4-6 注意问题 纯度A260/A280≧1.8≦2.0 长度分析:准确的要用脉冲场电泳 DNA完整性不好: 反复冻融, 样品太老, 中间步骤太剧烈 DNA干燥时要干但不能干过, 火候很重要 RNA的提取 RNA组成： rRNA: 80-90% mRNA: 2.5-5%(including precursors of regulatory RNA) tRNA: 10-15% 提取示例 样品保存 RNase is the devil in RNA lab! RNase的性质及对策 性质 对策 总RNA的提取 提取方法 有机溶剂法：如Trizol（苯酚+异硫氰酸胍）法 亲和纯化法：如膜亲和法 Trizol法的基本流程 贴壁细胞培养板(直接加入1ml/cm2)或50-100mg组织进行匀浆 4℃, 12,000g离心10min 室温5min使核酸蛋白质复合物解离 200ul氯仿剧烈震荡15s 室温静置5min 4℃ ,12,000g离心15min 取上清加入0.5ml异丙醇 12,000g离心10min 沉淀中加入1ml 75%的乙醇洗涤 ，7500g离心5min 室温干燥,溶解 亲和柱纯化 如果必要DNaseI 处理 mRNA 纯化 AAAAAA TTTTTT 常用试剂盒操作步骤的比较 RNA的定量 1. UV法: 1OD(260nm)unit=40 µ g/ml 2. 荧光法: 测定浓度比较低的RNA,如mRNA,Qbit检测试剂盒,5-100ng 如果A260/2