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Genome Walking 染色体步移技术（Genome Walking）是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。染色体步移技术主要有以下几方面的应用： 1. 根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究； 2. 步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列； 3. 鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等； 4. 用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列； 5. 用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接 主要原理是根据已知DNA序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物（SP Primer），与试剂盒中提供的四种经过独特设计的退火温度较低的兼并引物，即AP1、AP2、AP3、AP4进行热不对称PCR反应。通常情况下，其中至少有一种兼并引物可以与特异性引物之间利用退火温度的差异进行热不对称PCR反应，通过三次巢式PCR反应即可获取已知序列的侧翼序列。如果一次实验获取的长度不能满足实验要求时，还可以根据第一次步移获取的序列信息，继续进行侧翼序列获取。 特异性引物的设计 特异性引物设计原则： 根据经过验证的已知序列区（最好不少于500 bp）设计三个特异性引物（见上图）：设计方向为需要扩增的未知区域方向，SP2的位置应设计在SP1的内侧，SP3位于SP2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，一般以60~100 bp为宜。SP3 Primer不要距离未知序列区域太远，一般以100~200 bp为宜，以增加获取未知序列的有效长度。引物设计原则：引物的长度为22~26 nt，GC含量45~55％，Tm值60~70℃，引物Tm值计算公式：Tm=69.3+0.41（G/C）%×100 - 650/L（引物碱基数）。其他要求和普通PCR反应用引物相同。 实验操作流程 以使用兼并引物AP1为例 * 1 不同物种基因组DNA模板的使用量有不同的要求，具体见下表： * 2 特异性引物不同，退火温度也有差异。一般在60～68℃之间，推荐使用65℃退火。 * 3 可根据需要选择延伸时间，延伸时间长可以获取较长的DNA片段，但是容易产生非特异性PCR扩增。推荐延伸时间为2 min。 * 4 根据需要将上一步PCR反应液稀释1～1000倍后，取1 μl作为模板。此时首先建议使用PCR反应原液1 μl作为模板进行PCR反应。如果PCR扩增效果不理想，可以适当稀释PCR反应原液，再取1 μl进行PCR反应。