基因工程的操作过程重点.ppt

B 重组DNA分子的转化和扩增（转与增） 提高转化效率的几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时，细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 　　 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋DNA(cccDNA)。 转化效率与外源DNA浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA量过多或体积过大时，转化效率就会降低。 1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 　3. 试剂的质量: 所用的试剂，如CaCl2 等均需是最高纯度的，并用超纯水配制（过滤除菌，非高压灭菌），最好分装保存于干燥的冷暗处（冰箱4℃）。  　4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, 枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选和鉴定带来不必要的麻烦。  外源基因导入真核细胞的方法 1．酵母的转化一般有以下两种方法： (1) 利用酵母的原生质球进行转化 首先，酶解酵母细胞壁，产生原生质球，再将原生质球置于DNA、CaCl2和多聚醇(如聚乙二醇)中，多聚醇可使细胞壁具有穿透性，并允许DNA进入。然后使原生质球悬浮于琼脂中，并使其再生新的细胞壁。 (2) 利用Li+盐进行转化 这种方法不需要消化酵母的细胞壁，产生原生质球，而是将整个细胞暴露在Li+盐(如0.1 mol／L LiCl)中一段时间，再与DNA混合，经过一定处理后，加40％PEG4000，然后经热应激等步骤，即可获得转化体。 这种方法的主要缺点是，如果用自主复制的质粒进行转化，转化体的数目比用原生质球低10～100倍。 2．植物细胞的转化及其他基因转移方法 (1) 叶盘法 植物细胞转化常用的方法。先将实验材料 (如烟草)的叶子表面进行消毒，再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片，即叶盘。为了对叶盘进行接种处理，需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4～5min，然后用滤纸吸干，放在培养基上进行培养，需将叶子背面接触培养基。经过数周后，叶盘周围会长出愈伤组织并分化出幼苗。 叶盘法的优点是操作简便、适用性广，对于那些能被土壤农癌杆菌感染并能从离体叶盘形成的愈伤再生成株的各种植物都适用。 这种方法具有很高的重复性，便于大量常规地培养转化的植株。目前，这种方法已成为双子叶植物基因导入的主要手段。用这种主法所得到的转化体，其外源基因能稳定地遗传和表达，并按孟德尔方式分离。 (2)电击法 原理是，在强电压下，细胞膜会出现电穿孔现象。经过一段时间后，细胞膜上的小孔会封闭，恢复细胞膜原有特性。据此原理设计的电击法可用于基因转移。 电击法具有简便、快速、效率高等优点，但在植物中，由于细胞壁对外源基因的摄取有不利影响，所以一般以原生质粒为受体细胞。目前，该法用于烟草、玉米、水稻、小麦、高梁和大豆等植物，已得到了稳定的外源基因表达。 (3) 基因枪法 又称高速微型子弹射击法，它是将DNA吸附在由钨制作的微型子弹(直径约为1.2um)表面，通过特制的手枪，将子弹高速射人完整的细胞和组织内。 用这种方法，已将DNA先后送人酵母的线粒体和核、衣藻的叶绿体和核、洋葱的表皮细胞以及玉米悬浮细胞中。 基因枪法避开原生质体再生植株的难关，因此成为单子叶植物基因转移的有效途径。 3．哺乳动物细胞基因导入法 （1）磷酸钙沉淀法 具体做法大致是：先将需要被导人的DNA溶解在钙盐溶液中，然后在不停地搅拌下逐滴加到磷酸盐溶液中，形成磷酸钙微结晶与DNA的共沉淀物。再将这种共沉淀物与受体细胞混合、保温，DNA可以进入细胞核内，并整合到寄主染色体上。 这种方法多数用于单层培养的细胞，也可用于悬浮培养的细胞。 (2) 脂质体载体法 这种方法即用脂质体包埋核酸分子，然后将其导入细胞。脂质体是一种人工膜，制备方法很多，用于转移DNA的较理想的膜成分是带负电荷的磷脂酰丝氨酸。 做法大致是：将磷脂和DNA溶液溶解于大