口腔免疫研究方法总结.pptVIP

细胞凋亡检测样品的制备 将10×的结合缓冲液用蒸馏水稀释成为1×，冰育。 悬浮细胞在低温环境中，用PBS洗涤细胞。 离心后弃上清，加入预冷的结合缓冲液重悬细胞（细胞浓度为105～106／ml）。 加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI于细胞悬浮液中，轻轻混匀。 将试管置于冰上，避光孵育10分钟后上机检测。 微量全血法免疫荧光标记的样品制备 微量全血直接荧光染色法 取肝素或EDTA抗凝全血（100μl/份），置12×75mm专用塑料试管中。 加入20μl特异性荧光单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗作同型对照，室温下避光染色15min。 置 Q-PREP 仪上溶解红细胞、稳定和固定白细胞，静置5min，上机检测。 微量全血间接荧光染色法 取肝素或EDTA抗凝全血（100μl/份），置12×75mm专用塑料试管中。 加入50μl特异的单克隆抗体（一抗），室温下孵育30min。 置Q-PREP仪上溶解红细胞，稳定和固定白细胞。 离心后弃上清液， PBS洗涤细胞。 加入50μl荧光（FITC或PE）标记的第二抗体，室温下避光染色30min，上机检测。 6. 相关应用 分子生物学 细胞生物学 免疫学 肿瘤学 7. 口腔举例 牙髓干细胞的初步鉴定 收集无牙体牙髓疾病的恒牙，将拔除后的恒牙立即放人预冷含高倍双抗α-MEM培养基中保存，4h内原代取材。 体外原代培养的牙髓干细胞放入37℃、5%CO2培养箱中培养3d后弃去未贴壁细胞，PBS清洗后换液。 当第二代牙髓干细胞生长融合成单层后，0.25%胰蛋白酶消化，1：3传代。将扩增到一定数量的第二代细胞消化，PBS混悬后计数，调整细胞浓度（1×106～7/ml），离心后弃去上清。 PBS混匀后加入FITC-CD34和PE-STRO -1（stromal cell antigen，基质细胞抗原）混匀，冰盒内避光孵育1h后上机分选。 细胞组成 细胞功能 大小 细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 粒度 细胞活性 DNA, RNA含量 胞内细胞因子 蛋白质含量 激素结合位点 钙离子, PH值, 膜电位 酶活性 流式细胞仪常检测的细胞特性 小结 思考题： 影响免疫荧光技术非特异染色的主要因素及消除方法？ 如何避免Western blot非特异性条带的出现？ * 用于检测血清中抗核抗体、抗平滑肌抗体、抗线粒体抗体等自身抗体。 抗核抗体是一组对细胞核内的DNA,RNA,蛋白或这些物质的分子复合物的自身抗体，在多种自身免疫性疾病中呈不同程度的阳性率，如系统行红斑狼疮，结缔组织病，硬皮病等。 抗组蛋白，DNA；可提取的核抗原（ENA）；DNA SLE常出现核膜型（特异性）、均质型和混合型，斑点型多见于混合性结缔组织病， * 免疫荧光技术把显微镜技术的精确性和免疫学检测的特异性和灵敏性结合在一起，可以快速检测病原体，快速诊断方法，广泛应用于病毒、细菌病得诊断，也是许多动物寄生虫（如弓形虫病）的常规诊断方法 IFA是弓形虫检测的“金标准，更敏感地检测出早期弓形虫 * 检测组织中免疫球蛋白、补体、抗原抗体复合物以及肿瘤组织中肿瘤相关抗原的鉴定。 * 棘层松解， * * 基底膜损伤在OLP的发病至关重要，MMP能特异降解基底膜的成分 BCA * OLP患者中MMP-28表达明显高于正常口腔黏膜组织,且糜烂型表达明显高于其他类型 * 因此将 Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将细胞凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 * 2. Western Blot基本原理 蛋白质混合样品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）后分离为不同的条带，其中含有能与特异性抗体相结合的待检测的蛋白质（抗原蛋白）。将PAGE胶上的蛋白条带转移到硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，NC膜)，此过程称为印迹，以利于随后检测反应的进行。然后，将NC膜与抗体一起孵育，使抗体（一抗）与待检测的抗原决定簇结合（电泳分离的特异性蛋白条带），再与荧光素、酶或核素标记的二抗反应，即可检测出样品中的待测抗原并能对其定量。 Western blot原理 第八节 口腔免疫学研究的主要方法 Anode - 内槽缓冲液带有负电荷，与凝胶顶部接触 外槽中缓冲液带有正电荷，与凝胶底部接触 Cathode + 带有负电荷的蛋白质从上到下运动（负极到正极），分开 电泳进程可以根据前沿指示剂来确定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止电泳 小分子量蛋白跑的比较快. 蛋白根据分子量大小分开 蛋白质带有负电荷，因此电泳时可以从负极向正极移动 标本加入到上样孔中 3. Western Blot操作流程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 转膜 封闭 一抗杂交