真核基因表达系统.ppt

第八章 真核表达系统 Chapter 8 Eukaryotic expression system 概述( introduction ) 真核基因结构及表达调控特点( Features of eukaryotic gene structure and regulation) 真核表达系统(eukaryotic gene expression system) 酵母表达系统(yeast expression system) 哺乳动物细胞表达系统(mammalian cell expression) 昆虫细胞表达系统(insect cell expression ) 第一节 概述 一、真核基因组的复杂性 二、原核表达系统的局限性 三、真核表达系统的必要性及优势 一、真核基因组的复杂性 细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵子，共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA； 真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵子的结构。 真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多。 4. 真核生物基因编码复杂 原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组中仅约10%的序列为蛋白质、rRNA、tRNA等编码，其余约90%的序列功能至今还不清楚。 原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)和内含子(intron)，转录后需经剪接(splicing)去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。 原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组中则存在大量重复序列(repetitive sequences)。 真核生物mRNA 5’有帽状结构，3’末端有PolyA尾巴 二、 原核表达系统的局限性 1、没有转录后的剪接和加工系统 2、缺乏翻译后加工修饰系统：不能进行糖基化、磷酸化、甲基化的修饰，影响某些蛋白的活性。 3、在原核细胞中表达的真核蛋白不稳定 易被细菌蛋白酶降解; 难实现真正的分泌出胞，其产量很低; 而且容易出现信号肽不被切割，或不在特异位置上切割。 表达产物常以包涵体的形式存在，后期变性、复性的效率低 4、内毒素的污染 (contamination of endotoxin) 1. 具转录后加工系统: 2. 具翻译后修饰系统 3. 可实现真正的分泌表达 （一）真核基因表达调控特点 ---多层次、多方面 （二）真核基因表达的调控模式 真核基因表达的调控模式 ( The regulating model of eukaryotic gene expression) 1、转录前水平(基因组水平) ：gene level 2、转录水平调控: transcription level 3、转录后调控: post-transcription level 4、翻译水平的调控: translation level 5、翻译后修饰: post-translation modification 1、转录前水平(基因组水平)： gene level 基因结构的改变、稳定持久、不可逆，组蛋白修饰，DNA甲基化等 2. 转录水平调控 顺式调控元件(cis-acting element) 反式作用因子(trans-acting factor) （1 ）顺式调控元件(cis-acting element) 结构基因周围能与特异转录因子结合而启动 转录的DNA序列，主要包括： 起正性调节作用：启动子、增强子 起负性调节作用：沉寂子，终止子，加尾信号 启动子 位于基因5’末端与转录起始有关的核苷酸序列。作用特点是近距离作用、具有方向性、空间位置较恒定。一般包括 核心启动子元件（core promoter elements) ： 指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，决定基因转录的精确起始位点产生基础水平的转录，包括：转录起始点及-30区的TATA-box 上游启动子元件（upstream promoter elements) 包括 -70到-80bp区域的CAAT盒及其两侧的GC盒，协同决定转录的基础效率 组织特异性元件 诱导性启动子元件 增强子(enhancer)