免疫印记手册第六版介绍.docxVIP

PAGE \* MERGEFORMAT55 《蛋白质印迹手册》第六版 ??????? Western blotting技术作为生物实验室中最给力的工具之一，一直被研究人员广泛使用。默克密理博公司的《蛋白质印迹手册》（Protein Blotting Handbook）详细介绍了western blotting的原理、操作和技巧，无论是对初学者，还是对希望进一步优化实验的达人，都将带来极大的帮助。最新第六版的手册在优化抗体浓度和降低背景方面增加了更全面的指引，同时扩展了荧光检测的数据和操作步骤，是蛋白质印迹实验不可缺少的好伙伴。 一、??膜的选择： (p2)二、?蛋白质结合： (p5)三、印迹方法：原理与优化?(p2)1. 印迹原理与优化2. WB之蛋白分离3. WB之蛋白转移4. 转印缓冲液5. 影响转印的因素6. 开发一种新的转印操作7. 蛋白质观察四、?蛋白质鉴定： ? 1. 免疫检测2. 影响免疫检测的因素3. 质谱分析五、?实验操作： 1. 蛋白质转印操作 （1）湿转操作详解（2）半干转操作详解（3）狭缝印迹操作详解 2. 蛋白质观察操作 3. 免疫检测操作 （1）标准的免疫检测方法（2）快速的免疫检测方法 4. 膜剥离再生操作 5. 蛋白质消化 印迹保存操作 六、故障排查： 1. 故障排查2. 印迹失败的例子和原因 一、膜的选择 摘要：PVDF膜和NC膜作为Western印迹应用中最常用的两种类型的膜，各有什么特点？我们该如何选择？近四十年来，默克密理博一直是转印膜的领先供应商。它目前提供三种PVDF膜。这三种膜有何不同，分别适合哪些应用呢？详见本文。 印迹所使用的膜的类型可能影响下列因素： ? 蛋白质结合能力 ? 是否需要用醇预湿 ? 开展多次剥离（stripping）和再生检测（reprobing）实验的能力 ? 蛋白质观察 ? 长期印迹保存 ? 信噪比 聚偏二氟乙烯（PVDF）和硝酸纤维素(NC)是Western印迹应用中最常用的两种类型的膜。硝酸纤维素膜和PVDF膜的特性比较详见表1。 表1. PVDF和硝酸纤维素膜特性及应用的比较 与硝酸纤维素膜相比，电转到PVDF膜上有许多优点。PVDF膜可提供更好的蛋白质截留率、物理强度和广泛的化学兼容性（Pluskal等，1986）。其中更高的机械强度和出色的耐化学性让PVDF膜成为免疫检测中各种染色应用和二次检测的理想选择。使用PVDF膜的另一个优点是，单块凝胶上的平行重复泳道可用于各种应用中，如考马斯蓝染色，接着切割条带进行N端测序，蛋白质水解/肽段分离/内部测序，以及免疫检测（Kurien等，2003）。市售的硝酸纤维素膜的典型结合能力是80 – 100 μg/cm2，而PVDF膜的结合能力是100 – 200 μg/cm2。 在检测血清中人免疫缺陷病毒（HIV）时直接比较PVDF和硝酸纤维素膜，结果表明，PVDF膜有着更好的总体HIV抗原截留率，并且有助于改善提高抗体对糖基化包膜抗原的检测（Lauritzen和 Pluskal，1998）。 Immobilon? PVDF转印膜 默克密理博提供三种PVDF膜： ? Immobilon?-P膜（0.45 μm）是一种通用的基质，适用于一般的免疫印迹应用。 ? Immobilon?-PSQ膜（0.2 μm）适用于蛋白质测序和低分子量蛋白的免疫印迹。它有着更高的蛋白质结合能力以及比0.45 μm膜更高的截留率。 ? Immobilon?-FL膜（0.45 μm）是为荧光免疫检测而开发的。它在多种激发和发射波长范围内的荧光背景都极低。 Immobilon? 转印膜以卷膜和方片膜形式提供。预切好的膜与所有预制胶以及大部分市售的凝胶电泳系统兼容。Immobilon? 转印膜的性质详见表2。表3列出了与最常用的电泳系统相匹配的Immobilon? 预切膜的尺寸。表4列出了与现有的预制胶相匹配的Immobilon? 预切膜的尺寸。 表2. Immobilon? PVDF转印膜的性质和应用 表3. Immobilon? PVDF预切转印膜和匹配的电泳系统 表4. Immobilon? PVDF预切转印膜和匹配的预制胶 二、蛋白质结合 摘要：一旦膜被浸湿，蛋白质结合可通过蛋白质与膜的接触而实现。由于蛋白与膜结合的发生贯穿整个膜的厚度（深度），结合能力是由孔的内部表面积来决定的。Immobilon?-P与Immobilon?-PSQ转印膜在蛋白结合能力上有何差异？影响蛋白质结合的因素有哪些？ PVDF本质是一种疏水性的聚合物，在水溶液中不会浸湿。为了在水性缓冲液和系统中使用PVDF膜，首