Ad5E1A蛋白的表达、抗癌作用与相关新基因片段的筛选及在克服DXR中的功能研究.pdf

巾周卧和医科大学博士论文 I)cR chainreaction 多聚酶链反应 polymerase l巩GE Polyacrylmnidegelelectrophoresis聚丙烯酰氨凝胶 RT．PCRrovorse tnmscriptimlalpolymerasechain逆转录聚合酶链反应 reaction SSIt subtractive 抑制性削减杂交 suppression hybridization SDS sodium 十二烷基磺酸钠 dodecylsulphate TNF．1．1 Itnnornecrosisfactor-口 肿瘤坏死因子一n TMR T-cell-—mediated T细胞介导的免疫排斥反 allograflrejection 应 -4- 中国坍和医科大学博士论文 中文摘要 Ad5E1A蛋白的表达、抗癌作用和相关新基因片段的筛 选及在克服DXR中的功能研究 博士研究生：马业伟 导师z 赵清正研究员 腺jIii毒5型E1A(Ad5EIA)作为一个抑癌基因，由于具有较强抑癌 作用及妊著的化、放疗增敏作用而受到人们的关注．尽管EIA基因治疗肿 瘤取得了一些进展，但有些方面仍有待于进一步完善，如载体的靶向性及 特异性；靶基因表达的调控性等．为了避免EIA基因治疗中存在的问题， 我们’嫂想以EIA蛋白进行探索．首先构建了EIA真核表达载体 (pPIC9／EIA)，转化毕赤酵母细胞(GSll5)，筛选高表达重组菌株．经 摇瓶试验。甲醇诱导表达3天后，分泌型的EIA蛋白经HiTrapQ和HiTrap Sp两步柱层析，获得了较高纯度的EIA蛋白，并经SDS和Wcstcm blot鉴定．用Chariot介导将EIA蛋白转入细胞，且EIA蛋自主要定位在 细胞核LII．EIA蛋白有效的阻滞LN686细胞周期在G2／M期，并能显著抑 LN686刖一瘤细胞生长，增强作用机理不同的化疗药物对LN686肿瘤细 lJ4 胞的敏感性．此外，EIA蛋白／脂质体能显著抑制昆明小鼠体内的S-180肿 瘤和裸鼠体内的人LN686肿瘤生长、并在一定程度上增强博莱霉素对 S-180肿瘤的敏感性．原位凋亡分析表明，EIA蛋白的抗癌机制是诱导删t 瘤细胞凋I=． 山于EIA蛋白能抑制LN686肿瘤细胞的生长及提高对化、放疗的敏 感性，因此，利用抑制性削减杂交(SSH)技术在LN686细胞中筛选抗癌 眚1I关菇因．以EIA蛋白处理的州686细胞为实验方。以亲本1．,N686细胞 一 皇璺毁魏匿i±盔璧坚主丝塞 为驱动方．提取mRNA，反转录构建消减cDNA文库，文障包含火约7000 令戮性变隆，蘧辊攫取384个竟黢避孬PCR分爨，其巾362个克凝寡捶入 片段。约为200-600bp．通过斑点杂交技术证实避些基因在实验方中表达 较驱动蠢箍著挺瘫，砖鸯插入冀羧豹竟酝避露灏缪，劳谯GeneBank孛徽 阔源性比较，初步显示lO个为新EsTs，已在GeneBank中登录．对7个 新ESTs进行半寇盈RT-PCR篓怒证明这些基因在药物敏感肿瘤细施巾离 发达，ilii在不敏感豹亲本细胞巾则低表达，相差3—8倍。 异种器官移植lII存在三个阶段的免痰捧斥反应，即超急性捧斥反感 (HAR)，延缓燃|娶斥菠斑(DX歉)，T绷魅套葛l豹搀斥反瘟(TMR)，其 f|I第一阶段的HAR已有较好的解决办法，而第二阶段的DXR尚来见有安 矮毪遴袋。在DX