动物基因详解.ppt

第十一章 动物基因工程 什么是转基因动物？ 由于外源DNA的导入而产生了可以遗传的改变。这些遗传改变包括：1外源DNA片断至少整合到一条染色体上；2由于外源DNA的插入使任何一个基因发生改变；3由于外源DNA的插入使染色体发生重排；4有意识地导入可以持久存在的遗传实体，如一条人工染色体或可以复制并传递给子细胞的非染色体DNA元件。 下列原因导致的基因改变并不属于转基因动物范畴：由于化学品和辐射对DNA发生作用而产生的基因改变或是造成染色体畸变；把体细胞核移植到去核的卵母细胞中；基因治疗 转基因动物发展简史 1974年，Jaenisch和Mintz首次向移植前的小鼠囊胚注射SV40DNA后，在发育成的小鼠中检测到SV40的DNA序列 1980年，Gordon首次向单细胞胚胎的原核注射纯化的DNA，成功获得了转基因小鼠 1983年，Palmiter和Brinster等人 将生长激素基因转入小鼠，获得了生长 速度非常快的超级小白鼠 1985－1990年，研究转基因动物的高潮期，在此期间，兔、羊、猪、牛、鸡和鱼等各种转基因动物均取的成功，但大多数没有达到预期的目标（除了转基因鱼） 1987年，Gordon 等人首次在小鼠乳腺中表达了人tPA 1988年,Simons等，获得第一只用作乳腺生物反应器的转基因绵羊 1991,Ebert等；Wall等；Krimpenfort等，分别获得第一批用作生物反应器的山羊、猪和牛 1994年，首批动物乳腺生物反应器产品开始临床前实验 1996年，首批动物乳腺生物反应器产品开始临床实验 基因导入方法 显微注射方法 逆转录病毒载体感染法 精子载体法 卵母细胞胞质内精子微注射法 ES细胞介导的基因转移法 人工酵母染色体法 受体介导的基因转移 核移植法 脂质体介导法 电转移法也叫电脉冲刺激法或电场转移基因法 定位整合技术 转线粒体(基因)法 显微注射方法 该方法由Gordon 发明,是目前发展最早、应用最广泛和最为有效的制作转基因动物的方法。其基本原理是:通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵,利用受精卵繁殖中DNA 的复制过程,将外源基因整合到DNA 中,发育成转基因动物。采用此方法,上海转基因动物中心获得了EPO 转基因山羊。该方法整合率高,可对基因进行操作,常能得到纯系动物。缺点是成本高、对受精卵损伤较大,效率低。张靖潭等用目的基因与核定位蛋白基因细胞质共注射的方法,利用核定位蛋白的定向迁移功能将目的基因构件带入原核,提高了整合率。为减少对胚胎的伤害,还发展了一种扎刺法,但未见成功的报道。 显微注射设备 体视显微镜、Olympus 公司倒置显微镜及显微注射系统，制针设备购自日本Narishige公司;胚胎培养器皿为Falcon 3037、3003;显微注射用针自制。 DNA Microinjection of Fertilized Oocyte 逆转录病毒载体感染法 将目的基因重组到逆转录病毒载体上,制成高滴度的病毒颗粒,人为感染着床前后的胚胎,也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的,通过病毒将外源目的基因整合到宿主基因组DNA中去。Haskell等应用该方法制作了转基因牛。以逆转录病毒为载体导入外源基因时,外源基因多属单一位点单拷贝整合,整合率高,插入位点克隆分析较容易,这一点有别于显微注射法和精子载体法,这一特性已被广泛应用于基因定位整合等方面的研究中。但这个方法的缺点是对所转移的基因的大小有一定的限制,同时转移的基因在动物体内表达的问题还没有得到完全解决。 精子载体法 是一种直接用精子作为外源DNA 载体的基因转移方法。精子直接与外源DNA混合培养,外源基因可直接进入精子头部,受精后能发育成转基因动物。 共孵育法 电击法 脂质体法 Lipofectin脂质体,表面带有阳离子,可与带负电的DNA形成脂质体-DNA复合复。复合物通过静电作用被细胞吸附。 卵母细胞胞质内精子微注射法 由于精子载体法重复率低、结果不稳定。Anthony等(1999)报道了一种新的方法,即首先将精子与外源基因共孵育lmin,然后将精子的头部显微注入MII期的小鼠卵母细胞,在出生的后代中转基因阳性率可达20%以上,而且精子膜破损更有益于转基因动物的获得。这种方法使用的微注射针较原核显微注射针口径大100 倍,能处理兆碱基及亚兆碱基级的基因构建,如酵母或哺乳动物人工染色体。这些较大的构建含有表达所需的调控序列,能大大提高外源基因的整合及表达水平。对大型动物如牛、猪等而言,其合子是不透明的,原核不易见,原核显微注射较为困难,应用该法可克服此缺陷。而且在不同物种中,精子可以保存并且