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普通连接;目的：分离一个已知DNA序列，并以活体内方式获得许多复制品的过程。这一复制过程经常被用于增加并获取DNA片段中的基因，但也可用来增加某些任意的DNA序列，如启动子、非编码序列或是随机的DNA片断。
;方法;1、通过酶切的方法
酶的选择：
1、选择黏性末端的酶
2、选择配合较好的酶
3、避免平末端酶
4、避免同尾酶
如 bamh1 GGATCC和 bgl2 AGATCT
;2、PCR获得
一、引物设计
一般在扩增引物的5’端增加酶切位点，并且加保护碱基。
如
3、基因合成
在合成基因的同时，应将用于克隆的酶切位点一起合成。;克隆载体：
一、通过酶切获得的载体
二、PMD18-T
三、topo载体;一、通过酶切获得的载体
1、有合适酶切位点的载体，如：;2、无合适酶切位点的载体
这里可以用两中方法来做
1、通过突变PCR方法 增加酶切位点
2、将整个载体PCR下来，然后在引物两端增加两个酶切位点。
如：
;二、PMD18-T;三、topo载体;操作;二、PMD18-T
本载体1 μl（50 ng）
进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA 的摩尔数比一般为1：2～10
Solution I=pMD18-T Vector+insert
;三、topo载体
pEASY - Blunt Cloning Vector (10 ng/μl)
1、最佳插入片段DNA量：载体与片段摩尔比=1：7
2、最佳反应体系3-5 μl ，体积不足时可以补充无菌水
;其他克隆技巧;目的基因上有bamh1，可用bgl2来代替。
;2、补平
1、用于去酶切位点
SAC1酶切位点
5’ nnnnnnnGAGCTCnnnnnnn 3’
3’ nnnnnnnCTCGAGnnnnnnn 5’
酶切后
5’ nnnnnnnGAGCT 3’ Cnnnnnnn 3’
3’ nnnnnnnC 5’ 3’ TCGAGnnnnnnn 5’
Pfx 具有 3’?5’外切酶活性，补平后
5’ nnnnnnnG Cnnnnnnn 3’
3’ nnnnnnnC Gnnnnnnn 5’
连接
2、用于去除一段序列
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