分子克隆工具酶2解说.pptVIP

第二章基因工程的工具酶 基因工程的操作过程 DNA的体外重组（切、接） 重组DNA分子的转化和扩增（转、增） 转化子的筛选和鉴定（检） 基因工程的操作过程 DNA的体外重组（切、接） 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能；限制酶的分类与命名；Ⅱ型限制酶的特性与DNA切割；影响限制性核酸内切酶活性的因素； DNA连接酶 基本性质；连接作用；影响连接反应的因素； DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶；Klenow fragment；T7 DNA聚合酶；T4 DNA聚合酶；修饰过的T7 DNA聚合酶；逆转录酶； 核酸修饰酶 核酸酶；碱性磷酸单酯酶；T4多核苷酸激酶；末端转移酶。 甲基化酶 一.限制性核酸内切酶 核酸酶是通过切割相邻的两个核苷酸残基间的磷酸二酯键，导致多核苷酸链共价键断裂的一类水解酶。 按水解底物可分为核糖核酸酶(RNase)和脱氧核糖核酸酶(DNase)。 按其水解断裂核酸分子的不同方式： 核酸外切酶(exonuclease)：从核酸末端顺次水解磷酸二酯键； 核酸内切酶(endonuclease)：从核酸内部磷酸二酯键。 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能 寄主控制的限制(restriction)与修饰 (modification)现象： 侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。λ噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其他宿主时会受到限制。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 R/M体系 限制作用是指限制酶酶切降解外源DNA，保护宿主遗传稳定性的一种保护机制。 限制（ Restriction ） 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。 修饰（Modification） 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。 Dam甲基化酶 GATC腺嘌呤N6位置引入甲基 Dcm甲基化酶 CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基。 修饰（Modification） 限制酶的分类与命名 限制性内切酶是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。 由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。 根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNA的特点，可以将限制性内切酶分为三类：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶。 三种类型限制酶的主要特性差异比较 I型限制性内切酶 I型酶属复合功能酶，兼具限制、修饰两种功能。核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶4种活性。 显著特点：识别位点与切割位点不一致。 酶分子首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。 代表：EcoB和 EcoK。 Ⅲ类限制性内切酶 有核酸内切酶和甲基化酶作用。酶分子由两个亚基组成。M亚基负责位点识别与修饰，R亚基具有核酸酶活性。 　在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸 ）。 在基因工程操作中用途不大。 Ⅱ型限制性内切酶 1970年，由Smith和Wilcox从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是Hind Ⅱ。 限制-修饰系统分别由限制酶与修饰酶两种不同酶分子组成，分子量小，能识别DNA的特殊序列，种类多，在基因工程中起重要作用。 显著特点：能识别双链DNA的特殊序列，并在这个序列内进行切割，产生特异的DNA片段。其种类繁多 限制酶的命名 1973年Smith和Nathams提出限制酶的命名原则，1980年Roberts对其系统化，如今简化成： H i n d Ⅲ，来源菌株 Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株 Ⅱ型限制酶的特性与DNA切割 基本特点 识别双链DNA分子中4～8对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 PstI等产生的3’黏性末端 EcoR I等产生的5’粘性末端 粘性末端的意义 不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接,比连接两个平齐末端容易的多。 同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。 凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 补平成平末端：粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。 限制酶产生平末端 切割回文对称序列，产生平末端 HaeⅢ（GG↓CC） EcoRV（GAT↓ATC） 同裂酶 同裂酶：来源不同，识别相同的序列的限制性内切酶。 同序同切酶——识别序列和切割位置都相同； HindⅡ 与 HincⅡ 识别切割位点为