核酸研究的基本技术讲解.ppt

Tm值(DNA的熔点或解链温度) 概念：指加热变性使 DNA的双螺旋结构失 去一半时的温度。 分类 按用途分类 克隆载体 表达载体：含有强启动子，使克隆化的外源基因转录产生大量 的mRNA。依其发挥作用的宿主细胞不同，分为 原核、真核、酵母、昆虫、病毒表达载体。 分离：碱裂解法、煮沸法：剧烈，小质粒 去污剂(SDS)裂解法：易受损的大质粒 (15kb) 碱裂解法 1、原理: 模板变性、引物退火、DNA pol进行DNA合成 1)长度一般为18~25个碱基； 2)尽可能选择碱基随机分布的序列； 3)两条引物的G+C的百分比应尽量相似，多为45~55%； 4)避免引物内部形成二级结构； 5)两引物之间不应发生互补，特别是在3′端; 6)引物3′末端碱基可以影响Taq酶的延伸效率，最好 选T、G或C，而非A； 7)引物5′端允许有一段序列不与模板配对, 内切酶，保护碱基。 退火温度计算公式： 1) T=2×(A+T)+4×(G+C)-3~5 2) T=22+1.46 ln±3~5 ln=2(G or C)+(A or T) 20~35nt 3) T=81.5+16.6lg[J+]+0.41(G+C%)-(600/l)-0.63(FA%) [J+]=monovalent cations l=oligonucleotide length FA=formamide 14~70nt 3、影响因素 模板：ng级的质粒DNA，μg级基因组DNA。 引物：引物浓度不宜偏高，否则易形成引物二聚体。 Mg2+浓度：特异性及产量 dNTPs浓度：正确性和产量 Taq酶用量：非特异性 循环参数：常规为25~30个循环 4、特点：特异性、有效性、忠实性 操作简便省时； 灵敏度高； 特异性较强，但有一定的假阳性率。提高退火温度可以提高特异性； 对原始材料的质量要求较低； 有一定程度的单核苷酸错误掺入。因为Taq DNA聚和酶缺乏3’→5’核酸外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入。 1.第一链的合成至关重要 1) 确定所需的mRNA的存在 2) mRNA中存在的稳定二级结构可能对反转录有影响， 采用热稳定的具反转录活性的DNA聚合酶 2.反转录结束后通过两次NH4Ac沉淀去除多余dNTP和引物 3.内源性同聚序列的影响 1)降低引物的用量 0.5pmol/μg mRNA/20μl反应体积 2)避免太低的杂交温度 1)大量扩增目的核酸片段 2)克隆新基因 3)生物多态性的研究 4)核酸测序 5)在核酸中引入突变 6)检测基因的整合、表达情况 7)疾病的诊断 1.需突变位点位于基因两侧，只需在合成引物时，直接加上突变碱基即可； 2、当突变位于基因的中间部位时，可以采用以下两种方法进行突变 DNA的序列测定：Sanger双脱氧链终止法测序的原理 8、限制性核酸内切酶 核酸酶：是一类能切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二 酯键，使核酸分子多核苷酸链发生水解的蛋白酶。 基因工程中最常用的核酸酶是核酸内切酶。 限制性核酸内切酶: 简称限制酶，是一类能识别双链DNA分子 中特异核苷酸序列的DNA水解酶，它能特 异地结合于限制酶识别序列或其附近的位 点，并在此切割双链DNA分子。 分类 I类: 识别部位复杂，特异性差，在识别序列周围400~ 7000bp范围内切割DNA。 II类：能识别双链DNA的特定序列并进行切割，产生特异 的DNA片段，常规应用于分子克隆中。 III类：在识别位点周围27~27bp范围内切割DNA。 命名原则 特征 识别序列：4~6个核苷酸，迴文结构。 切割产物：同时切割dsDNA的两条链 平滑末端或粘性末端 酶活性单位 一个活性单位：在适当的反应条件，1小时， 完全酶解1μg DNA底物，