生化试验电泳技术要点解析.pptVIP

电 泳 技 术 本次实验利用SDS方法检测层析液中的抗体 【原理】 1、抗体IgG由两条重链（分别为50kD）和两条轻链（分别为25kD）组成。 2、 SDS能确定样品中蛋白质的分子量。 【流程】 1、从各收集管中取出部分样品，进行SDS电泳。 2、利用标准蛋白样品的分子量和迁移率，绘制标准曲线。 3、根据各收集管中蛋白的迁移率，计算分子量。 4、根据各收集管中是否同时含有50kD和25kD的条带，确定该管中是否含有抗体， 利用SDS方法检测层析液中的抗体 利用SDS方法检测层析液中的抗体 【预期检测结果】 泳道2、标准分子量蛋白 泳道3、不结合的蛋白峰 泳道4-10、结合的蛋白峰1，含抗体蛋白 泳道11-15、结合的蛋白峰2，含杂蛋白 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 IgG重链50k IgG轻链25k NaCl浓度 0 1.0 A 280 nm 操作步骤 1：清洗玻璃板，组装（按上次实验分组，每组制两块胶） 2：制分离胶，10% 3：制浓缩胶， 4：加样， 5：通电，开始100 V，样品进入分离胶后，改为150 V 6：染色，1小时 7：脱色，1-3天 利用SDS方法检测层析液中的抗体 * 电泳技术 * 生命科学学院 生物化学实验 之 2013.9 1. 电泳技术的基本原理 电泳：带电粒子在电场中的定向移动。 影响泳动率的因素： 内因：1.净电荷 2.质点大小 3.质点形状 外因：1.电场强度 2.缓冲液的pH 3.离子强度 1. 电泳技术的基本原理 电泳类型 ⑴区带电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。 凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳包括：垂直板、盘状、等电聚焦、梯度、双向电泳 ⑵自由界面电泳 支持物为溶液，很少用。 2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O3，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2,C17H2O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。 2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 聚合反应： 丙烯酰胺 (acrylamide) 聚丙烯酰胺 (polyacrylamide) 单体 交联剂 三维网状立体结构的大分子 甲叉双丙烯酰胺 (bisacrylamide) 催化聚合 + 网孔的大小取决于单体和交联剂总量和比例 2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 催化系统 光聚合： 核黄素为催化剂(阳光,日光)，用于制大孔胶。 化学聚合： 过硫酸铵(NH4)2S2O3 （APS）作为引发剂， N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂， 用于制小孔胶和大孔胶。 2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 分离机制：三种物理效应 1）电荷效应：每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁移率不同。有效电荷多的，泳动的快，反之则慢。 2）分子筛效应：分子量大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受凝胶阻滞的程度不同，表现出不同的迁移率。 3）浓缩效应：样品在分离之前，首先在浓缩胶得到浓缩，变成狭窄（很薄）的样品带，使分辨率大大提高。 样品浓缩效应：由凝胶系统的不连续性产生。 ①凝胶孔径不连续性 ②缓冲液离子成份的不连续性 ③PH的不连续性 2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 负极 正极 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应 电泳缓冲液 Tris-Gly，pH 8.3 样品 Tris-HCl，pH6.7 浓缩胶，T=2.5% Tris-HCl，pH6.7 分离胶, T=7% Tris-HCl，pH8.9 电泳缓冲液 Tris-Gly，pH 8.3 3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳