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荧光实时定量PCR原理及应用 l 实时荧光定量PCR检测技术的原理 RQ—PCR技术是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。Ct值(cycle threshold，Ct)，即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光达阈值的循环数越少，即Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 2 实时荧光定量PCR检测技术的分类 根据所使用的荧光化学物质的不同，实时荧光定量PCR主要分为2类，分别是荧光探针和荧光染料。荧光探针又可分为水解探针、双杂交探针、分子信标和复合探针。荧光染料目前主要是以SYBR Green I为主的一种扩增序列非特异性的检测方法。 2.1水解探针 以TaqMan探针为代表的水解探针，又叫外切核酸酶探针。其原理是应用Taq酶天然的5-3’核酸外切酶的活性。如图所示。能够使双链DNA的5’核苷酸裂解单核苷酸释放。根据Taq酶这一特性，依照目的基因设计一个能与之的异性结合的探针，探针的5’端标记荧光报告基团如FAM，3’端标有荧光猝灭基团如BHQ，两者构成能量传递。正常情况下两者距离很近形成能量传递，5’端发出的荧光被3’端荧光猝灭基团所吸收或者抑制而不出现荧光信号的变化。 PCR扩增时，引物和探针都结合在模板上，探针在引物的上下游之间。随着反应的进行当扩增延伸到探针结合的位置时，利用Taq酶的5’到3’外切酶活性将探针切断，破换了2个荧光分子之间的能量传递，使3’端的猝灭作用解除，5’端FAM的荧光信号被释放出来。PCR每复制一个特异性核苷酸片段，就会有一个探针被切断，同时一个5’端的报告基团发出的荧光信号被检测出。这样PCR产物与荧光信号之间形成一一对应的关系。因为循环参数Ct与起始模板数的对数成负相关，通过制定的标准曲线，再根据待测样品的Ct值就能确定起始模板的数量。因此，根据PCR反应体系的荧光强度就能准确的计算出起始模板的拷贝数。 图2 TaqMan探针荧光实时定量原理 图3 双杂交探针实时定量PCR原理 2.3分子信标 又称分子灯塔法，是一种根据荧光共振能量转移原理建立起来的荧光定量技术。其原理如图4所示。分子信标长约25 nt，是一段能够与靶标核苷酸序列互补的探针。它的空间结构成颈环结构，颈长约5-7 nt，由与目标序列无关的互补序列构成，其另一端连有荧光基团另一端连有猝灭基团。环序列是与靶标序列互补的探针；当没有靶标序列时，分子信标呈现颈环结构，颈部的荧光基团与猝灭基团十分接近可以发生RFRET；荧光基团发出的荧光被猝灭基团所吸收，此时并不能检测到荧光信号。 当靶标序列存在时，环序列与靶标序列结合形成双链结构比无靶标序列的颈环结构更稳定，这种结构使荧光基团与猝灭基团分开，荧光基团发出的荧光并不能被猝灭基团所吸收，因此可以检测到荧光信号。 图4 分子信标实时荧光定量PCR原理 2.4 复合探针 这种探针结合了双杂交探针和分子信标的优点，同样需要合成2条探针，第1条探针的5”端连人荧光基团，第2条探针的3’端连入一个荧光猝灭基团，第1条探针的荧光基团可以和第2条探针的猝灭基团杂交。其原理如图5所示。当2个探针结合时荧光基团发出的荧光信号被猝灭基团所吸收因此不能检测到荧光信号。当2个探针分开时，荧光探针发出的荧光信号就不能够被猝灭探针的猝灭基团吸收，因而能够检测到荧光信号。当反应体系中没有与之结合的模板时，2个探针发生杂交，无荧光检测信号。 当PCR反应体系中存在模板时，探针与模板结合而分开，从而有荧光信号产生。荧光信号的强度与模板的数量成正比，因而可以进行PCR定。 图5 复合探针荧光实时定量PCR原理 2.5 SYBR荧光染料 SYBR是一种特异的结合小沟的双链DNA的染料，当其与双链DNA结合后能发出荧光信号。而不与双链DNA结合的SYBR GreenI染料不会发出荧光。使荧光信号的强度与PCR扩增产物的增加同步。其原理如图6所示。SYBR GreenI在实时定量检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，仅需2个用于扩增的引物，不需设计探针对其标记。成本更低廉。不必因模板不同而特别定制，设计的程序通用性