传代培养细胞的染色体标本的制备分析.pptxVIP

传代培养细胞染色体标本的制备原理在细胞的生长周期中，中期染色体的长短、大小、恒定性正适合对其进行分析、研究。因此利用人工的方法，使细胞分裂处于中期而不向后期转化，并收获细胞，经处理，制片后观察分析。器材与试剂培养箱、普通光学显微镜、离心机、水浴箱、天平等。试管架、刻度离心管、滴管和滴头、酒精灯、冰载玻片等。器材与试剂Hela细胞含10%小牛血清DMEM秋水仙素（5微克/毫升）0.075MKcl固定液（甲醇/冰乙酸3:1）乙酸优点：乙酸具有很强的穿透性能，甚至比乙醇的穿透性要高。能使核酸沉淀，阻止染色体收缩，使染色体结构免于破坏。经乙酸固定的物质，还能抵消甲醇的硬化作用。缺点：不能固定细胞质蛋白，并导致染色体片段的过分膨胀，故如要形成染色体的详细结构，必须把它与甲醇或类似的化学物质一道使用，后者能使组织收缩和硬化。甲醇作用：迅速穿透组织，沉淀蛋白质，具有脱水性。蛋白质的不可逆转的变性，使组织硬化、脱水，固缩作用能迅速进入细胞。操作1、细胞培养2、秋水仙素处理：加秋水仙素20ul（5微克/毫升），混匀，37℃，4h。3、收集细胞：胰酶消化细胞（方法同细胞传代---胰酶处理前用PBS洗一次），用培养液将细胞收集到离心管中，1500r/min离心，10min。5、低渗处理：弃上清，加8ml（视细胞量多少而定）0.075MKCl溶液，充分混匀（注意吹打不要过猛），置37℃水浴20min。（KCl：使细胞和核膨胀，染色体松软，迅速分散。0.075MKCl：染色体轮廓清晰，可染性强，染色时间短，充分显示带型）操作6、预固定：低渗处理后，加0.5-1ml固定液轻轻混匀，1500r/min离心，10min。（预固定可以固定染色体结构，并使细胞慢慢脱水，防止细胞离心破裂）。7、固定：弃上清，加8ml（视细胞量多少而定）固定液，充分混匀，室温静置15min，1500r/min离心，10min。8、制备细胞悬液：弃上清，视细胞数量多少加适量固定液制成细胞悬液。9、制片：取细胞悬液2-3滴，滴于冰玻片上，并迅速吹片，酒精灯火焰烤干。10、烤片：37℃，一周。结果光镜100倍下人染色体G带照片注意事项胰酶消化细胞的时间一定要控制好秋水仙素的浓度及处理时间很重要。（或秋水仙酰胺）低渗液的浓度与处理时间应掌握好。固定液应临用时新鲜配制。